Оценка противовирусной активности бактерий, входящих в состав препарата Проваген, на модели вируса болезни Марека 3-го серотипа

210
Оценка противовирусной активности бактерий, входящих в состав препарата Проваген, на модели вируса болезни Марека 3-го серотипа

В. Н. Афонюшкин, кандидат биологических наук, заведующий сектором молекулярной биологии, Сибирский федеральный центр агробиотехнологий Российской академии наук, Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск
А. Н. Ширшова, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, ООО «Ветбиотест», Новосибирск
Д. В. Шамовская, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, ООО «Ветбиотест», Новосибирск
Д. А. Пломодьялов, кандидат ветеринарных наук, ООО «ТрионисВет», Минск

В своей клинической практике мы регулярно сталкивались с ситуациями, когда введение пациенту антибиотика широкого спектра действия сопровождалось диарейным синдромом.

Рассматривая это явление как постантибиотический дисбиоз, мы тем не менее нередко обнаруживали обострение различных вирусных инфекций, как в кишечнике, так и в респираторной системе. Если обострение респираторных вирусных инфекций при постантибиотическом дисбиозе легко объяснялось повышением реактивности организма в ответ на изменение состава кишечной микробиоты, то накопление вирусов (реовирусов, флавивирусов и т.д.) в кишечнике заставило нас выработать гипотезу о взаимодействии вирусов и бактерий.

В просвете кишечника вирусные частицы (вирусы эукариот) являются для бактериальных клеток всего лишь скоплением белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и, в ряде случаев, липидов. Поэтому вирусы должны достаточно активно разрушатся бактериями и в кишечнике (по-видимому, между воспроизводством вирусных частиц в слизистой кишечника и их разрушением бактериальной микробиотой наблюдается динамическое равновесие).  Следовательно, снижение концентрации бактерий должно приводить к накоплению вирусных частиц в просвете кишечника, к росту числа инфицированных клеток кишечника и к развитию диареи или вирусной мальабсорбции. Для проверки гипотезы о разрушении вирусов бактериями мы изучили повреждающее действие бактерий рода Bacillus входящих в состав препарата Проваген в отношении вируса болезни Марека 3-го серотипа (вируса герпеса индеек).


ПЦР в режиме реального времени на наличие вируса герпеса индеек FC126:1 – контроль (исходный образец вакцины); 2 – отрицательный контроль (разведенная вакцина без Провагена); 3 – вакцина + Проваген в концентрации 8 log10 КОЕ/мл. Чем раньше появляется сигнал (обозначен овалами) тем больше вируса было в образце


Результаты ПЦР в режиме реального времени на наличие геномной ДНК ФС 126 (вируса герпеса индеек)


Материалы и методы


Исследования проводили на базе лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и сектора молекулярной биологии СФНЦА РАН.

В 450 мл фосфатно-солевого буфера (содержащего вакцинный штамм FC 126) вносили разведенный Проваген в объеме 50 мкл и титровали с шагом 1:10, получив концентрации 3,5 × 10⁸  – 3,5 × 10⁵ КОЕ/мл. Инкубировали при 37 °С в течение 4 часов после чего выделяли ДНК силикосорбционным методом. Также проводили контрольные постановки без Провагена и без вируса. Все опыты выполняли в четырех повторениях. Концентрацию бактерий определяли методом последовательных разведений на Eugonic- агаре.

Наличие геномной ДНК вируса герпеса индеек выявляли с помощью ПЦР в режиме реального времени. ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис-HCl (рН 8,9); 16 мМ сульфата аммония; 2,4 мМ MgCl2; 0,01 % Твин 20; 0,2 мM дНТФ; 0,5 мкM раствора олигонуклеотидных праймеров и 1ED Taq-полимеразы. ПЦР в режиме реального времени с SYBRGreen проводили на амплификаторе CFX (BiRad) с начальной денатурацией при 95 °С 3 мин., далее в течение 45 циклов с денатурацией при 95 °С 10 сек., отжигом при температуре 62 °C в течение 10 сек. и синтезом при 72 °С в течение 10 сек. Финальная элонгация проводилась 3 мин при 72 °С.

Результаты исследования

Как следует из полученных данных (см. таблицу и диаграмму), в течение четырех часов инкубации активности бактерий в составе препарата Проваген недостаточно для полной инактивации вирусных частиц (вируса герпеса индеек, штамм FC 126). Однако статистически достоверно (р <0,05) повышается пороговый цикл (Сt) в ПЦР, специфичной в отношении вируса герпеса идеек. Это свидетельствует о снижении концентрации вирусной ДНК в культуральной жидкости.

Следует учитывать, что для разрушения вирусной ДНК необходимо последовательное разрушение вирусной оболочки, слоя капсомеров (последовательно липазой и протеазой), и только после этого, в течение довольно продолжительного времени, будет происходить разрушение собственно вирусной ДНК. То есть вирусные частицы с разрушенной ДНК были инактивированы бактериями задолго до расщепления нуклеиновой кислоты.

На данном этапе мы можем утверждать, что в составе препарата Проваген есть микроорганизмы, способные разрушать герпес-вирусы. Для полной инактивации вирусов и их генетического материала, требуется или более длительная экспозиция, или более высокая концентрация бактерий, или более высокая активность ферментных систем.

Заключение

Бактерии, входящие в состав препарата Проваген, способны статистически достоверно снижать концентрацию вируса болезни Марека, что дает основание рекомендовать его распыление в птичниках по завершении дезинфекции.

О Компании "Трионис Вет"

«Трионис Вет» - отечественный производитель и поставщик ветеринарных препаратов, витамино-минеральных комплексов и кормовых добавок для сельскохозяйственных животных.

В настоящее время предприятие поставляет на рынок высококачественные ветеринарные препараты собственного производства - основных и востребованных ветеринарными специалистами групп антибиотиков. Производство препаратов осуществляется на современном технологическом оборудовании при использовании зарубежных технологий и рецептур, разработанных специалистами компании с учетом пожеланий ветеринарных врачей сельскохозяйственных предприятий.

Компания разработала и вывела на российский рынок споровый концентрированный пробиотический препарат под торговой маркой «ПРОВАГЕН концентрат», производство которого соответствует необходимым стандартам качества и обеспечивает высокую биологическую активность пробиотического препарата.

Последняя инновация и ноу-хау компании «Трионис Вет» – уникальный противовирусный препарат прямого действия «ТРИВИРОН», который применяется для профилактики и лечения вирусных инфекций. "Нам удалось создать препарат на основе искусственных рибонуклеаз - синтетических аналогов ферментов, которые расщепляют вирусные РНК. Испытания доказали, что препарат эффективен в ветеринарии для лечения заболеваний, вызываемых РНК-содержащими вирусами».

«Трионис Вет» представляет комбинированный антистрессовый препарат нового поколения «Magic Antistress», механизм действия которого основан на концепции витагенов, получившей международное признание. В состав антистрессового препарата «Magic Antistress» входят именно те вещества, которые способны предельно мобилизовать защитные силы организма животного и свести к минимуму отрицательные последствия стрессов.

Компания «Трионис Вет» также является эксклюзивным дистрибьютером  корейской компании «Самбвет», французской компании «Artimon» и английской компании «Feed Food», которые выпускают ветеринарные препараты и кормовые добавки на производственных площадях, сертифицированных по GMP.
+7 (499) 753-83-93
141092, Московская область, г. Королев, мкр. Юбилейный, ул. Лесная, д.14, оф.5