Болезнь Ньюкасла – высококонтагиозное и разрушительное вирусное заболевание, домашняя птица, которая распространилась по всему миру, причинив большие экономические потери в птицеводстве. Хотя для борьбы с этим заболеванием используются вакцины, эффективных противовирусных препаратов для лечения инфекций не существует. Целью этого исследования является проверка чесночного масла на его противовирусную активность против вируса болезни Ньюкасла. Чесночное масло инкубировали с вирусом (штамм LaSota) в течение 1 часа и 24 часов, и его противовирусный эффект определяли путем проведения тестов гемагглютинации и ОТ-ПЦР для обнаружения поверхностных белков вируса и вирусного генома соответственно. Кроме того, токсичность чесночного масла определяли на живом организме путем введения его куриным эмбрионам с вирусом или без него. Результаты показали, что этот продукт сыграл роль в снижении эффективности вируса за счет разрушения поверхностных рецепторов вируса, а также снижения амплификации генов по сравнению с контрольной группой, которая включала обработку вируса физиологическим раствором (фосфатный буфер). физиологический раствор), что дало противоположные результаты. Кроме того, противовирусная токсичность в отношении живого организма отсутствовала, поскольку эмбрионы, которым вводили только масло или масло с вирусом, были здоровыми и очень напоминали эмбрионы, которым ничего не вводили. Для сравнения, эмбрионы, которым вводили вирус, демонстрировали только явные патологические признаки, которых не было в других группах, содержащих масло. Эти результаты позволяют предположить, что чеснок
Масло может быть хорошим потенциальным противовирусным средством и, вероятно, сыграет роль в ликвидации болезни.
ВВЕДЕНИЕ
Болезнь Ньюкасла — высококонтагиозное и разрушительное вирусное заболевание широкого спектра птиц, особенно домашней птицы. Вызывается вирусом болезни Ньюкасла, принадлежащим к семье Парамиксовирид. Заболевание потенциально может нанести большой экономический ущерб птицеводству. Ожидается, что все птицы восприимчивы к инфекции с различными клиническими признаками и исходами.
На данный момент не существует эффективного лечения болезни Ньюкасла, хотя вторичные инфекции, вызванные бактериями, можно лечить с помощью антибиотиков, поэтому срочно необходимы новые альтернативные меры борьбы. Недавние исследования подтвердили эффективность чеснока и его экстрактов в широком спектре медицинских применений. Эти исследования выявили возможность возрождения терапевтической ценности чеснока при различных заболеваниях. Считается, что различные соединения в чесноке обладают противоопухолевым и противомикробным действием. Кроме того, он может снизить риск сердечно-сосудистых заболеваний, а также показать пользу при высокой концентрации глюкозы в крови. По сравнению с антибактериальным действием соединений чеснока, было проведено очень ограниченное количество исследований по изучению их противовирусных свойств. В нескольких исследованиях сообщалось, что экстракт чеснока показал активность in vitro против гриппа А и В, риновируса, вируса иммунодефицита человека, цитомегаловируса, вирусной пневмонии, вируса простого герпеса 1, вируса простого герпеса 2 и ротавируса.
Цель настоящей работы — проверить противовирусную активность чесночного масла в отношении вируса болезни Ньюкасла. Цель была достигнута путем оценки активности чесночного масла в отношении разрушения внешних рецепторов вирусных белков и деградации вирусной нуклеиновой кислоты вируса с помощью методов гемагглютинации и ОТ-ПЦР соответственно. Кроме того, токсичность масла измеряли путем инокуляции куриных яиц с эмбрионами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вирусы
В этом исследовании использовали запас живого лентогенного вируса болезни Ньюкасла (вакцина ЛаСота).
Перед использованием его разбавляли 1:1000 физиологическим раствором фосфатного буфера (PBS).
Экстракция масла из чеснока
Сушеный чеснок был куплен в супермаркете, а затем измельчен с помощью электрической машины. измельчить, а затем хранить в стеклянных бутылках до использования. Семьдесят граммов сушеного чеснока поместили в бумажный контейнер (наперсток) в экстракционный аппарат (суккулет) с использованием 500 мл этанольного растворителя примерно на 6 часов. Затем раствор помещали в ротационный испаритель при
50°С.◦С для испарения растворителя, а оставшийся материал оставляли при комнатной температуре для высыхания и получения чесночного масла, а затем помещали в винтовую трубку до использования.
ПРОТИВОВИРУСНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЧЕСНОЧНОГО МАСЛА
Роль чеснока в ингибировании эффективности вируса посредством разрушения вирусных рецепторов или деградации вирусной нуклеиновой кислоты была исследована с помощью методов гемагглютинации и ОТ-ПЦР соответственно. Концентрация чесночного масла, используемого для лечения вируса, составляла 50 мкг/мл. Для этого были подготовлены пять групп. Группа 1 и 2 включала инкубацию чесночного масла с вирусом в течение 1 часа или 24 часов соответственно, тогда как группа 3 и 4 представляла собой использование чесночного масла без вируса (отрицательный контроль 1) или PBS (отрицательный контроль 2). Группа 5 была представлена использованием вируса только без чеснока (положительный контроль).
Подготовка эритроцитов
Пять микролитров крови цыплят собирали в вакуумные пробирки (ЭДТА.К3) и эритроциты очищали следующим образом: цельную кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут и супернатант отбрасывали. Эритроциты суспендировали в PBS путем осторожного перемешивания в пробирке. Затем смесь центрифугировали в течение 5 минут при 2000 об/мин и надосадочную жидкость отбрасывали. Этот процесс повторяли 3-4 раза, пока супернатант не очистился. Затем количество эритроцитов сохранялось на уровне 4.◦C или используется непосредственно для реакции гемагглютинации.
Гемагглютинация
Роль чесночного масла в ингибировании эффективности вируса за счет разрушения вирусных рецепторов была исследована с помощью теста гемагглютинации. Керамическую пластинку для агглютинации, содержащую шесть лунок, очистили и подготовили для этого эксперимента. Каплю вируса, обработанную чесночным маслом в течение 1 часа или 24 часов, смешивали с еще одной капля эритроцитов в лунку. Отрицательные контроли 1 и 2 были представлены путем смешивания капли эритроцитов с другой каплей только чесночного масла или с PBS соответственно. Образец положительного контроля представлял собой смешивание капли эритроцитов с каплей необработанного вируса. реакцию оставляли на несколько минут для визуализации результатов.
Экстракция и количественная оценка вирусной РНК
Вирусную РНК экстрагировали в лаборатории с помощью набора для экстракции вирусной РНК QIAamp (Qiagen, Германия) согласно инструкциям производителя.
Концентрацию очищенной РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop по УФ- поглощению. Элюированные образцы вирусной РНК либо обрабатывались непосредственно для RT-PCR, либо хранились при –20°C до использования.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой
Вирусы выявляли с помощью наборов для двухэтапной ОТ-ПЦР («Bioneer», Южная Корея) по протоколу производителя. Синтез кДНК и ПЦР-амплификацию проводили в двух отдельных пробирках с использованием этой системы. Компоненты реакции кДНК с их объемами и конечными концентрациями были следующими: В качестве исходного материала использовали четыре микролитра матричной РНК в сочетании с 0,4 мкл прямого и обратного праймеров (конечная концентрация каждого праймера составляла 0,2 пмоль/ мкл). Затем к реакции добавляли пятнадцать целых два микролитра воды, не содержащей нуклеазы. Реакции отрицательного контроля готовили либо без добавления праймеров (отрицательный контроль 1), либо без матрицы РНК (отрицательный контроль 2). Условия первого этапа были следующими: отжиг праймера при 58°С в течение 10 мин, затем синтез кДНК при 42°С в течение 30 мин и затем этап денатурации при 95°С в течение 5 мин.
Затем два микролитра синтезированной кДНК использовали для выполнения второго этапа (ПЦР-амплификации). К реакции добавляли четыре микролитра прямого и обратного праймеров с 17,2 мкл воды, не содержащей нуклеазы. Условия ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 40 циклов: денатурация при 95°С в течение 30 с, отжиг при 58°С в течение 30 с и удлинение при 72°С в течение 1 мин. Затем реакцию выдерживали при 72°С в течение 5 минут, а затем охлаждали до 4°С в течение 5 минут. Затем амплифицированный продукт ПЦР детектировали с использованием 2% агарозного геля, приготовленного с агарозой (Promega), в буфере TBE, окрашенном бромидом этидия. Размер полосы оценивали путем сравнения со стандартной лестницей ДНК длиной 100 п.о.
Инокуляция куриных яиц с эмбрионами
Чтобы определить токсичность и эффективность чесночного масла на живые организмы, оплодотворенные куриные яйца, предоставленные компанией Fadak, Басра, Ирак, были инокулированы маслом с самой низкой концентрацией (50 мкг/мл), что ингибировало инфекционность вируса перед инокуляцией яиц. Оплодотворенные яйца сначала инкубировали в течение 9 дней при температуре 37,5°C, затем инокулировали вирус. Рабочую концентрацию вируса готовили путем разведения исходного вируса 1:1000 в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1% антибиотиков (100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, Gibco).
Объем инокулята составлял 100 мкл на яйцо. Для этого готовили пять групп яиц (по 10 яиц в каждой группе). Группу 1 и 2 инокулировали смесью чесночного масла и вируса, которые вместе инкубировали в течение 1 часа или 24 часов соответственно. Группу 3 и 4 инокулировали чесночным маслом или вирусом соответственно. Яйца группы 5 вообще не инокулировались.
После инокуляции яйца помещали при 37,5°С на 48 часов. Затем яйца охлаждали при температуре 4°C в течение 30 минут, а затем собирали эмбрионы и собирали вирус. Аллантоисную жидкость осторожно аспирировали, затем осветляли при 1000 g в течение 5 минут, а эмбрионы перемещали в чашки Петри для визуализации патологических изменений.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Определение противовирусной эффективности перед инъекцией куриных эмбрионов
Серологическое выявление вируса методом гемагглютинации.
Роль чесночного масла в ингибировании эффективности вируса за счет разрушения вирусных рецепторов оценивалась путем проведения реакции гемагглютинации. Результаты были следующими: инкубация чесночного масла с вирусом в течение 1 часа или 24 часов показала полное ингибирование эффективности вируса. Кроме того, использование только чесночного масла (отрицательный контроль 1) или только PBS (отрицательный контроль 2) также не выявило агглютинации. Для сравнения, очень четкая агглютинация наблюдалась после использования вируса только без чесночного масла (положительный контроль). Приведенные выше результаты показали, что чесночное масло эффективно разрушает поверхностные рецепторы вируса, что предотвращает прикрепление вируса к эритроцитам и, таким образом, ингибирует реакцию агглютинации (рис. 1).
Рисунок 1: Противовирусная эффективность чесночного масла на поверхностных рецепторах вируса болезни Ньюкасла (предварительная инъекция яичных эмбрионов).
Молекулярное обнаружение вируса методом RT-PCR
Роль чесночного масла в ингибировании эффективности вируса за счет разрушения нуклеиновой кислоты вируса оценивали с помощью теста RT-PCR. Результаты были следующими: хорошая амплификация вирусной нуклеиновой кислоты с очень четкими полосами образцов положительного контроля (вирус без чесночного масла). Кроме того, группа отрицательного контроля 1 (без праймеров ПЦР в реакции ПЦР) и группа отрицательного контроля 2 (без вирусной РНК в реакции ПЦР) не показали обнаруживаемых полос. С другой стороны, наблюдалась плохая амплификация (слабые полосы) и плохая амплификация или отсутствие амплификации (слабые полосы или отсутствие полос) вирусной нуклеиновой кислоты вирусов, обработанных чесночным маслом в течение 1 часа и 24 часов соответственно. Приведенные выше результаты показали, что чесночное масло эффективно разрушает нуклеиновую кислоту вируса, что приводит к плохой амплификации генов или к ее отсутствию (рис. 2).
Рисунок 2. Противовирусная эффективность чесночного масла в отношении нуклеиновой кислоты вируса болезни Ньюкасла (предварительная инъекция яичных эмбрионов).
На рисунке показано обнаружение вируса болезни Ньюкасла на агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Результаты показали хорошую амплификацию вирусной нуклеиновой кислоты в образцах положительного контроля (дорожки 1 и 2), тогда как в образцах отрицательного контроля (дорожки 3 и 4) и (дорожки 5 и 6) нуклеиновая кислота не амплифицировалась вообще. В образцах, обработанных чесноком, наблюдалась незначительная амплификация нуклеиновой кислоты (по сравнению с положительным контролем) после инкубации вируса с лекарственным средством в течение 1 часа (дорожки 7 и 8), а амплификация была намного меньше после инкубации чеснока с вирусом в течение 24 часов ( полоса 9 и 10).
Противовирусная эффективность чесночного масла в отношении вируса болезни Ньюкасла после инъекции куриных эмбрионов:
Определение токсичности и эффективности чесночного масла на куриных эмбрионах:
Токсичность и эффективность чесночного масла измеряли после инокуляции куриных яиц с эмбрионами самой низкой концентрацией масла (50 мкг/мл), которая ингибировала инфекционность вируса до инокуляции яиц. Результаты были следующими: после инокуляции яиц смесью чесночного масла и вируса, инкубированных вместе в течение 1 часа или 24 часов, эмбрионы были нормальными и не имели никаких патологических признаков, таких как кровотечение, деформация или повреждение. Аналогичные результаты наблюдались после инокуляции яиц только чесночным маслом, а также неинъецированных яиц. С другой стороны, после инокуляции яиц только вирусом на эмбрионах четко наблюдались такие патологические признаки, как кровотечение или деформация или повреждение эмбрионов.
Результаты токсичности и эффективности показаны на (Фиг.3).
Рисунок 3. Обнаружение токсичности и эффективности чесночного масла на куриных эмбрионах.
На рисунке показано влияние чесночного масла на вирус, а также его влияние на куриные эмбрионы. Патологические признаки, такие как петехиальные кровоизлияния и деформация эмбриона, отчетливо наблюдались после инъекции яиц вирусом, не обработанных чесночным маслом. Напротив, эмбрионы выглядят вполне нормально после инъекции вируса, обработанного чесночным маслом в течение одного часа и 24 часов, что указывает на то, что чеснок сыграл важную роль в снижении инфекционности вируса. Эмбрионы также были нормальными после инъекции только чесночного масла, не было никаких кровотечений и деформаций, и они были аналогичны группе, не подвергавшейся инъекции.
Обнаружение вируса в аллантоисной жидкости методом гемагглютинации:
Тест гемагглютинации проводился для обнаружения роста вируса в аллантоисной жидкости, собранной из инокулированных яиц, содержащих только вирус, вирусов, обработанных чесночным маслом, и неинокулированных яиц. Результаты были следующими: никаких признаков гемагглютинации в аллантоисной жидкости яиц, инъецированных вирусом, обработанным чесночным маслом, в течение 1 часа или 24 часов.
Аналогичные результаты были замечены в яйцах, которым вводили только чесночное масло (отрицательный контроль 1), и в яйцах без инъекций (отрицательный контроль 2). Напротив, очень заметная гемагглютинация наблюдалась в аллантоисной жидкости яиц, инъецированных только вирусом (положительный контроль).
Приведенные выше результаты показали, что чесночное масло эффективно разрушает поверхностные рецепторы вируса перед инъекцией куриных яиц с эмбрионами, что в конечном итоге предотвращает репликацию вируса внутри аллантоисных клеток.(Цифры 4).
Рисунок 4. Противовирусная эффективность чесночного масла после инъекции куриного яйца с эмбрионом.
Обнаружение вируса в аллантоисной жидкости методом RT-PCR:
Вирус был обнаружен в аллантоисной жидкости инъецированных яиц путем проведения
ОТ-ПЦР. Результаты были следующими: вирусная нуклеиновая кислота была успешно обнаружена в образцах положительного контроля (яйца, инъецированные только вирусом) с очень четкими полосами, которые легко наблюдать на геле. Напротив, вирусная нуклеиновая кислота не была обнаружена в яйцах, которым инъецировали только чесночное масло, а также в яйцах, которым инъецировали вирус, обработанный чесночным маслом в течение 1 часа и 24 часов, а также в неинъецированных яйцах.
Приведенные выше результаты объяснили роль чесночного масла в более точном разрушении нуклеиновой кислоты вируса. Хотя перед инокуляцией яиц наблюдалась небольшая амплификация вирусной нуклеиновой кислоты вирусов, обработанных маслом, эта амплификация полностью исчезала после инокуляции (рис. 5).
Рисунок 5: Молекулярное обнаружение вируса болезни Ньюкасла после инъекции куриных яиц с эмбрионами с чесночным маслом.
На рисунке показано обнаружение вируса болезни Ньюкасла на агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Результаты показали хорошую амплификацию вирусной нуклеиновой кислоты в образцах положительного контроля (дорожки 1 и 2), тогда как в образцах отрицательного контроля (дорожки 3 и 4) и (дорожки 5 и 6) нуклеиновая кислота не амплифицировалась вообще. Никакой амплификации также не наблюдалось в образцах, обработанных чесноком в течение 1 часа (дорожки 7 и 8) и 24 часов (дорожки 9 и 10).
ОБСУЖДЕНИЕ
Чесночное масло было протестировано как противовирусное средство против вируса болезни Ньюкасла, а результаты оценивались с использованием методов гемагглютинации и ОТ- ПЦР, а также инокуляции вирусом куриных яиц с эмбрионами. Результаты показали, что чесночное масло обладает отличной способностью уничтожать вирус, разрушая рецепторы на поверхности вируса и генетический материал внутри. Кроме того, было обнаружено отсутствие токсичности или патологического воздействия этого масла на организм, что подтверждено инъекциями куриных эмбрионов, и эффективно контролировался вирус, поскольку в аллантоисных жидкостях всех обработанных групп вирусы не были выявлены.
Недавнее исследование рассмотрело Солодка голая экстракт листьев может стать потенциальным противовирусным средством in vivo против вируса болезни Ньюкасла. Исследование показало, что этот экстракт сыграл роль в уничтожении вируса с высокой выживаемостью инокулированных куриных эмбрионов. Это согласуется с результатами настоящего исследования, поскольку все инъецированные эмбрионы были здоровыми и патологических поражений не наблюдалось. На
с другой стороны, в другом исследовании оценивалась цитотоксичность и противовирусная активность ивермектина, препарата, используемого для лечения многих типов паразитарных инвазий, таких как чесотка, головные вши, стронгилоидоз, против вируса болезни Ньюкасла; и рибавирин, противовирусный препарат, используемый для лечения РСВ-инфекции, гепатита С, лихорадки Ласса и тяжелых случаев гриппа.
Исследование пришло к выводу, что ивермектин обладает сильным противовирусным потенциалом при дозе 100 мкг/мл и выше, но некоторые концентрации были цитотоксичными, тогда как рибавирин продемонстрировал сильный противовирусный потенциал во всех концентрациях. В текущем исследовании концентрация чесночного масла, составлявшая 50 мкг/мл, дала хорошие результаты в уничтожении вируса без токсичности, наблюдаемой у куриных эмбрионов.
Исследование показало, что фукоидан изКладосифон окамурануспроявил противовирусную активность в отношении штамма LaSota вируса болезни Ньюкасла и представляет собой потенциальное малотоксичное противовирусное соединение для птицеводства. Другое исследование показало, что этаноловые экстракты Акация цианофилла листья, Моринга сапсан листья Эвкалипт камальдульский фрукты и Фисташка Атлантическая(листья и стебель) могут полностью ингибировать вирус болезни Ньюкасла, не вызывая гибели куриного эмбриона.
Однако реакция инфицированных вирусом куриных эмбрионов была различной в зависимости от вида лекарственного растения, концентрации внесенного растительного материала и части растения. Кроме того, некоторые растительные экстракты показали дозозависимую связь со степенью ингибирования вируса, тогда как другие растительные экстракты показали некоторую токсичность для куриного эмбриона. Результаты нашего исследования показали, что текущие дозы чесночного масла не оказывают никакой токсичности на куриные эмбрионы и полностью уничтожают вирус, и, следовательно, чесночное масло может быть потенциальным противовирусным препаратом против вируса болезни Ньюкасла.
В этом исследовании было показано, что чесночное масло играет большую роль в разрушении поверхностных рецепторов вируса, и это было обнаружено с помощью теста гемагглютинации. С другой стороны, некоторые слабые полосы или отсутствие полос появлялись на агарозном геле после проведения RT-PCR на вирусах, обработанных чесночным маслом, однако после амплификации генома вируса, взятого из аллантоисных жидкостей, не было обнаружено никаких обнаруживаемых полос.
Незначительная амплификация вирусного генома в образцах, обработанных маслом, вероятно, будет содержать следы фрагмента РНК вируса, с которым были связаны праймеры, и эти фрагменты были амплифицированы с помощью RT-PCR, поэтому это не будет иметь биологического значения.
В заключение, основываясь на результатах, полученных в этом исследовании, можно предположить, что чесночное масло является хорошим потенциальным противовирусным средством против вируса болезни Ньюкасла. Однако необходима дальнейшая работа для более глубокого изучения эффекта этого продукта, например, определение его влияния на культуру клеток и использование других молекулярных и серологических методов для обнаружения вируса, и, следовательно, требуются дальнейшие исследования.
