С. Федотов, М.Черных, Е. Капитонов, Алтайский ГАУ
Проблема диагностики ассоциированных инфекций в промышленном птицеводстве приобрела особую значимость в связи с изменением формы инфекционной патологии и появлением экзотических заболеваний.
В последние годы наблюдается увеличение удельного веса инфекций, вызванных ассоциациями условно-патогенных микроорганизмов. Они характеризуются выраженным клиническим полиморфизмом, связанным с одновременным воздействием нескольких агентов, что затрудняет интерпретацию результатов лабораторных исследований, так как каждая из составляющих микст-культур обладает рядом признаков, сочетание которых может определять патогенный потенциал возбудителей в целом.
Установлено, что такие заболевания препятствуют выявлению основного этиологического агента, вызывающего инфекционный процесс, и затрудняют проведение этиотропной противоинфекционной терапии. Также не полностью расшифрована структура самих микробных ассоциаций, не в достаточной мере выявлена роль некоторых составляющих микроорганизмов в их прямом или опосредованном влиянии на организм птицы.
В то же время межбактериальные взаимодействия как один из механизмов формирования ассоциаций микроорганизмов и проявления их патогенных свойств изучены недостаточно в связи с несовершенством методов диагностики.
Проводя вскрытие больной птицы на яичных птицефабриках («Молодёжная» Первомайского района и «Павловская» Павловского района), мы находили деформированные фолликулы, содержимое которых было разжижено или уплотнено. В их оболочках отмечали точечные кровоизлияния. Однако рядом с патологическими наблюдались и нормально сохранившиеся фолликулы. Клиническое проявление фолликулита яичника у кур-несушек сопровождалось прекращением яйценоскости.
Анализируя биохимические изменения в крови клинически больной птицы, данные патолого-анатомического вскрытия и результаты морфологических исследований, можно предположить, что характер патоморфологических изменений структуры фолликулов яичника указывает на выраженное цитотоксическое действие возбудителя инфекции. Наблюдается усиление лимфоцитарной инфильтрации фолликулярной и текальной оболочек, увеличение количества форменных элементов крови и тканевых базофилов.
У кур с патолого-анатомическими признаками фолликулита яичник был контаминирован стафилококками, кишечной палочкой, стрептококками и протеем во все сроки наблюдений. Максимальное число такой птицы установлено в период активной яйценоскости. Микрофлора преимущественно была в форме ассоциаций, при этом в большей степени выделялись организмы с высокой степенью вирулентности, такие, как золотистый стафилококк и гемолитические штаммы эшерихий.
Так, из фолликулов яичников кур в возрасте 150-250 дней стафилококки отмечены чаще, чем другие микроорганизмы, — в 56 случаях (63,64%). В том числе с кишечной палочкой — в 14 (15,92%); с кишечной палочкой и стрептококком — в 8 (9,09%); со стрептококком — в 1 (1,14%); с протеем — в 7 (7,95%); с протеем и кишечной палочкой — в 4 (4,55%) и в 22 (25,0%) — в виде монокультур.
Высокой степенью высеваемости характеризовалась и кишечная палочка (42,05% случаев), особенно со стафилококками (15,92% случаев). Число птицы, у которой из содержимого фолликулов выделяли ассоциации кишечной палочки со стрептококком, составило 3 (3,41%) головы. В 2 (2,27%) случаях она наблюдалась с протеем, в 8 (9,09%) — со стафилококками и стрептококками, в 10(11,36%) — в виде монокультур.
В большинстве случаев стрептококки и протеи из содержимого фолликулов в виде монокультур изолировали только от трупного материала взрослых кур, а стафилококки и кишечную палочку высевали как из трупов, так и вынужденно убитой птицы.
При микробиологической диагностике репродуктивных органов у клинически здоровых кур стафилококки, энтерококки и др. не высевались. Фолликулы яичников были округлой формы различной величины. Их содержимое жёлтого цвета, и консистенция средней густоты.
Заболевания яичников у птицы имеют полимикробную этиологию, ведущая роль в которой принадлежит условно-патогенным микроорганизмам, преимущественно в ассоциациях факультативно-анаэробной и анаэробной микрофлоры. Наши данные подтверждаются экспериментами Batra C.L., Singh В., Crewal C.S., SodhiS.S. (1982).
Микробиологические исследования показали, что на птицефабриках удаётся обнаружить распространение штаммов стафилококков следующих видов: St. aureus (72,7%), St. saprophyticus (13,6%) и St.epidermidis (13,6%). При проведении дальнейшей типизации St. aureus выявили различные биологические варианты. Так, от кур с клиникой фолликулита яичника выделяли биовары hominis, gallinae и А/В. Кроме них на «Павловской» птицефабрике высеян биовар C/D, а на «Молодёжной» — canis. Тем не менее наблюдалась положительная корреляционная связь между биологическими вариантами стафилококков вида St. aureus, выделенных на обеих птицефабриках (г=0,79).
В результате серологической типизации 78 энтеропатогенных культур 87% из них отнесены к сероварам: 01, 02, 078, 09, 055, OIII и OI4I. При этом к серотипу 02 мы отнесли 65,5% культур, к 078 — I 3,3, к 01 — 11,6%, к 09, OIII, OI4I — по одной культуре E.coli, к 055 — 2 культуры. Таким образом, наиболее распространенными и вирулентными для лабораторных животных были культуры эшерихий сероваров 01, 02, 078.
В процессе исследований выделено три группы стрептококков: b-гемолитические (Str. hemolyticus), вызывающие гемолиз эритроцитов; а-зеленящие (STR. viridans), образующие вокруг колоний зеленую зону гемометаморфоза; негемолитические у-стрептококки (Str. anhemolyticus), не изменяющие эритроциты и не вызывающие гемолиз кровяного агара. Из 32 культур стрептококков, выделенных в динамике заболевания кур, патогенными для белых мышей оказались 14, что составляет 39,64 процента.
Изучая морфологические и культурально-биохимические свойства бактерий из рода протея, выделенных из поражённых фолликулов, провели типизацию. Протея, разлагающего глюкозу (К+Г+) и сахарозу, отнесли к виду мирабильного (Proteus mirabilis), а разлагающего глюкозу (К+Г+), сахарозу и мальтозу — к вульгарному (Proteus vulgaris). Микробы этой группы характеризовались высокой степенью патогенности: 14 (57,33%) из 27 культур оказались патогенными для белых мышей.
Обобщая полученные результаты микробиологических исследований, отмечаем, что из поражённого яичника выделяли стафилококки, представленные St. aureus, St. saprophyticus и St. epidermidis и Е. coli в виде сероваров 01, 02, 078. Реже отмечены стрептококки и Protei vulgaris.
Полученные результаты подтверждаются исследованиями Датского института болезней птиц (Bisgaard M., Dam A., 1981). Они выявили смешанную микрофлору из поражённых половых органов кур в 16 случаях (11%), в то время как неспецифический рост — в 3. Обнаружили 19 различных О-групп кишечной палочки, наиболее часто встречался серотип 02.
В январе-феврале прошлого года было исследовано 600 ослабленных цыплят кросса F-15 в возрасте 1-5 дней. В результате у 1 70 голов выделена Е. coli; у 1 30 — St. aureus и Е. coli; у 60 - St. aureus; у 60 — St. aureus, Citrobacter frendi и Е. coli; у 90 — Citrobacter frendi и E. coli.
При микробиологическом исследовании эмбрионов (1 проба — 5 эмбрионов в возрасте 21 дня) выявлено 1 7 проб Е. coli; 1 3 — St. aureus и Е. coli; 6 — St. aureus; 6 — St. aureus, Citrobacter frendi и Е. coli; 9 — Citrobacter frendi и Е. coli.
Традиционно применяемые таксономические методы идентификации патогенных микроорганизмов на птицефабриках Алтайского края основаны на использовании различных хемотаксономических тестов, таких, как специфическая ферментативная активность, способность метаболизировать сахар или поддерживать рост на средах с селективными добавками.
Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.
В значительной мере бактериологи продолжают зависеть от морфологических и биохимических критериев при определении микроорганизмов, выделяемых из патологического материала и объектов окружающей среды.
В некоторых случаях идентификация и классификация патогенных микроорганизмов не отвечает запросам ветеринарной практики. Обусловлено это наличием ряда обстоятельств; основные: неудовлетворительная экспрессия фенотипических признаков, прежде всего факторов патогенности у бактерий в различных условиях их культивирования; существование некультивируемых бактерий; способность более чем 20 видов патогенных бактерий переходить в состояние покоя, характеризующееся резко сниженной метаболической активностью и временной потерей способности к размножению; наличие генетического механизма, осуществляющего постоянное изменение антигенных детерминант в организме-хозяине, что, с одной стороны, помогает возбудителю выживать в макроорганизме, уходя от воздействия иммунного ответа организма-хозяина, а с другой — приводит к неудачам лабораторной диагностики при использовании сероиммунологических методов.
Следует признать, что в лабораторной практике также существуют естественные ограничения при использовании фенотипических методов оценки лекарственной устойчивости возбудителей ассоциированных инфекций.
Дискодиффузный метод определения чувствительности к противомикробным препаратам является доминирующим в практической деятельности ветеринарных лабораторий Алтайского края.
Его основное достоинство — простота в исполнении и экономическая доступность. До настоящего времени он остаётся предпочтительным для большинства лабораторий.
Вместе с тем очевидны его недостатки: метод используют при определении чувствительности к антибиотикам ограниченного числа микроорганизмов; он непригоден, если микроб не образует на поверхности агаризированной питательной среды или гомогенный газон определённой плотности, или газон образуется после 24-часовой инкубации бактерий, а грибов — после 48 часов.
Для реализации метода пригоден узкий круг питательных сред, зачастую не предназначенных для роста требовательных микроорганизмов. Зона подавления роста микроба не всегда адекватна его истинной чувствительности к противомикробным средствам и т.д.
Кроме того, результаты хемотаксономических тестов могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов, поэтому не являются основанием для оценки их чувствительности.
Из представленных примеров видно, что в арсенале современных бактериологических лабораторий птицефабрик должны быть методы, позволяющие идентифицировать, классифицировать и дифференцировать патогенные микроорганизмы независимо от формы или состояния.
Помимо традиционных способов определения видовой принадлежности возбудителей ассоциированных инфекций должно уделяться внимание их геномным характеристикам. Это особенно важно для тех микроорганизмов, которые претерпевают адаптивные изменения под воздействием неблагоприятных экологических факторов, антибактериальной терапии, при контакте с больной птицей и продуктами птицеводства.
Методы индикации микроорганизмов должны сочетать быстроту, специфичность, обладать функцией мультиплексности, соответствовать современному уровню развития лабораторного дела.
К таким сегодня относятся ПЦР и секвенирование чувствительности и специфичности, которые превосходят все существующие до настоящего времени хемотаксономические методы, поскольку выявляют гены (нуклеиновые кислоты) возбудителей, а не антигены и антитела.
Применение ПЦР-диагностики для выявления источника возникновения очага инфекции, выделение и изучение возбудителей инфекционных болезней (ассоциированных инфекций) как в течение эпизоотии, так и в межэпизоотический период позволит следить за изменением генетической структуры микроорганизмов, предсказывать появление новых вариантов и создавать адекватные средства защиты и диагностические препараты. Помимо этого она позволяет определять наличие возбудителя в период так называемого «серологического окна», то есть в промежутке между моментом инфицирования организма и появлением антител в количествах, достаточных для определения.
Метод ПЦР обладает рядом преимуществ перед хемотаксономическими методами. К настоящему времени материальная база для его успешного применения достаточно развита. Все её компоненты (приборы, наборы для выделения ДНК, ферменты и т.д.) широко представлены на рынке и становятся доступными по цене. Внедрение его позволит более эффективно проводить лечение и профилактику заболеваний, вызванных ассоциированными инфекциями.
Статья была опубликована в журнале «Птицеводство», 2010 год.
Проблема диагностики ассоциированных инфекций в промышленном птицеводстве приобрела особую значимость в связи с изменением формы инфекционной патологии и появлением экзотических заболеваний.
В последние годы наблюдается увеличение удельного веса инфекций, вызванных ассоциациями условно-патогенных микроорганизмов. Они характеризуются выраженным клиническим полиморфизмом, связанным с одновременным воздействием нескольких агентов, что затрудняет интерпретацию результатов лабораторных исследований, так как каждая из составляющих микст-культур обладает рядом признаков, сочетание которых может определять патогенный потенциал возбудителей в целом.
Установлено, что такие заболевания препятствуют выявлению основного этиологического агента, вызывающего инфекционный процесс, и затрудняют проведение этиотропной противоинфекционной терапии. Также не полностью расшифрована структура самих микробных ассоциаций, не в достаточной мере выявлена роль некоторых составляющих микроорганизмов в их прямом или опосредованном влиянии на организм птицы.
В то же время межбактериальные взаимодействия как один из механизмов формирования ассоциаций микроорганизмов и проявления их патогенных свойств изучены недостаточно в связи с несовершенством методов диагностики.
Проводя вскрытие больной птицы на яичных птицефабриках («Молодёжная» Первомайского района и «Павловская» Павловского района), мы находили деформированные фолликулы, содержимое которых было разжижено или уплотнено. В их оболочках отмечали точечные кровоизлияния. Однако рядом с патологическими наблюдались и нормально сохранившиеся фолликулы. Клиническое проявление фолликулита яичника у кур-несушек сопровождалось прекращением яйценоскости.
Анализируя биохимические изменения в крови клинически больной птицы, данные патолого-анатомического вскрытия и результаты морфологических исследований, можно предположить, что характер патоморфологических изменений структуры фолликулов яичника указывает на выраженное цитотоксическое действие возбудителя инфекции. Наблюдается усиление лимфоцитарной инфильтрации фолликулярной и текальной оболочек, увеличение количества форменных элементов крови и тканевых базофилов.
У кур с патолого-анатомическими признаками фолликулита яичник был контаминирован стафилококками, кишечной палочкой, стрептококками и протеем во все сроки наблюдений. Максимальное число такой птицы установлено в период активной яйценоскости. Микрофлора преимущественно была в форме ассоциаций, при этом в большей степени выделялись организмы с высокой степенью вирулентности, такие, как золотистый стафилококк и гемолитические штаммы эшерихий.
Так, из фолликулов яичников кур в возрасте 150-250 дней стафилококки отмечены чаще, чем другие микроорганизмы, — в 56 случаях (63,64%). В том числе с кишечной палочкой — в 14 (15,92%); с кишечной палочкой и стрептококком — в 8 (9,09%); со стрептококком — в 1 (1,14%); с протеем — в 7 (7,95%); с протеем и кишечной палочкой — в 4 (4,55%) и в 22 (25,0%) — в виде монокультур.
Высокой степенью высеваемости характеризовалась и кишечная палочка (42,05% случаев), особенно со стафилококками (15,92% случаев). Число птицы, у которой из содержимого фолликулов выделяли ассоциации кишечной палочки со стрептококком, составило 3 (3,41%) головы. В 2 (2,27%) случаях она наблюдалась с протеем, в 8 (9,09%) — со стафилококками и стрептококками, в 10(11,36%) — в виде монокультур.
В большинстве случаев стрептококки и протеи из содержимого фолликулов в виде монокультур изолировали только от трупного материала взрослых кур, а стафилококки и кишечную палочку высевали как из трупов, так и вынужденно убитой птицы.
При микробиологической диагностике репродуктивных органов у клинически здоровых кур стафилококки, энтерококки и др. не высевались. Фолликулы яичников были округлой формы различной величины. Их содержимое жёлтого цвета, и консистенция средней густоты.
Заболевания яичников у птицы имеют полимикробную этиологию, ведущая роль в которой принадлежит условно-патогенным микроорганизмам, преимущественно в ассоциациях факультативно-анаэробной и анаэробной микрофлоры. Наши данные подтверждаются экспериментами Batra C.L., Singh В., Crewal C.S., SodhiS.S. (1982).
Микробиологические исследования показали, что на птицефабриках удаётся обнаружить распространение штаммов стафилококков следующих видов: St. aureus (72,7%), St. saprophyticus (13,6%) и St.epidermidis (13,6%). При проведении дальнейшей типизации St. aureus выявили различные биологические варианты. Так, от кур с клиникой фолликулита яичника выделяли биовары hominis, gallinae и А/В. Кроме них на «Павловской» птицефабрике высеян биовар C/D, а на «Молодёжной» — canis. Тем не менее наблюдалась положительная корреляционная связь между биологическими вариантами стафилококков вида St. aureus, выделенных на обеих птицефабриках (г=0,79).
В результате серологической типизации 78 энтеропатогенных культур 87% из них отнесены к сероварам: 01, 02, 078, 09, 055, OIII и OI4I. При этом к серотипу 02 мы отнесли 65,5% культур, к 078 — I 3,3, к 01 — 11,6%, к 09, OIII, OI4I — по одной культуре E.coli, к 055 — 2 культуры. Таким образом, наиболее распространенными и вирулентными для лабораторных животных были культуры эшерихий сероваров 01, 02, 078.
В процессе исследований выделено три группы стрептококков: b-гемолитические (Str. hemolyticus), вызывающие гемолиз эритроцитов; а-зеленящие (STR. viridans), образующие вокруг колоний зеленую зону гемометаморфоза; негемолитические у-стрептококки (Str. anhemolyticus), не изменяющие эритроциты и не вызывающие гемолиз кровяного агара. Из 32 культур стрептококков, выделенных в динамике заболевания кур, патогенными для белых мышей оказались 14, что составляет 39,64 процента.
Изучая морфологические и культурально-биохимические свойства бактерий из рода протея, выделенных из поражённых фолликулов, провели типизацию. Протея, разлагающего глюкозу (К+Г+) и сахарозу, отнесли к виду мирабильного (Proteus mirabilis), а разлагающего глюкозу (К+Г+), сахарозу и мальтозу — к вульгарному (Proteus vulgaris). Микробы этой группы характеризовались высокой степенью патогенности: 14 (57,33%) из 27 культур оказались патогенными для белых мышей.
Обобщая полученные результаты микробиологических исследований, отмечаем, что из поражённого яичника выделяли стафилококки, представленные St. aureus, St. saprophyticus и St. epidermidis и Е. coli в виде сероваров 01, 02, 078. Реже отмечены стрептококки и Protei vulgaris.
Полученные результаты подтверждаются исследованиями Датского института болезней птиц (Bisgaard M., Dam A., 1981). Они выявили смешанную микрофлору из поражённых половых органов кур в 16 случаях (11%), в то время как неспецифический рост — в 3. Обнаружили 19 различных О-групп кишечной палочки, наиболее часто встречался серотип 02.
В январе-феврале прошлого года было исследовано 600 ослабленных цыплят кросса F-15 в возрасте 1-5 дней. В результате у 1 70 голов выделена Е. coli; у 1 30 — St. aureus и Е. coli; у 60 - St. aureus; у 60 — St. aureus, Citrobacter frendi и Е. coli; у 90 — Citrobacter frendi и E. coli.
При микробиологическом исследовании эмбрионов (1 проба — 5 эмбрионов в возрасте 21 дня) выявлено 1 7 проб Е. coli; 1 3 — St. aureus и Е. coli; 6 — St. aureus; 6 — St. aureus, Citrobacter frendi и Е. coli; 9 — Citrobacter frendi и Е. coli.
Традиционно применяемые таксономические методы идентификации патогенных микроорганизмов на птицефабриках Алтайского края основаны на использовании различных хемотаксономических тестов, таких, как специфическая ферментативная активность, способность метаболизировать сахар или поддерживать рост на средах с селективными добавками.
Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.
В значительной мере бактериологи продолжают зависеть от морфологических и биохимических критериев при определении микроорганизмов, выделяемых из патологического материала и объектов окружающей среды.
В некоторых случаях идентификация и классификация патогенных микроорганизмов не отвечает запросам ветеринарной практики. Обусловлено это наличием ряда обстоятельств; основные: неудовлетворительная экспрессия фенотипических признаков, прежде всего факторов патогенности у бактерий в различных условиях их культивирования; существование некультивируемых бактерий; способность более чем 20 видов патогенных бактерий переходить в состояние покоя, характеризующееся резко сниженной метаболической активностью и временной потерей способности к размножению; наличие генетического механизма, осуществляющего постоянное изменение антигенных детерминант в организме-хозяине, что, с одной стороны, помогает возбудителю выживать в макроорганизме, уходя от воздействия иммунного ответа организма-хозяина, а с другой — приводит к неудачам лабораторной диагностики при использовании сероиммунологических методов.
Следует признать, что в лабораторной практике также существуют естественные ограничения при использовании фенотипических методов оценки лекарственной устойчивости возбудителей ассоциированных инфекций.
Дискодиффузный метод определения чувствительности к противомикробным препаратам является доминирующим в практической деятельности ветеринарных лабораторий Алтайского края.
Его основное достоинство — простота в исполнении и экономическая доступность. До настоящего времени он остаётся предпочтительным для большинства лабораторий.
Вместе с тем очевидны его недостатки: метод используют при определении чувствительности к антибиотикам ограниченного числа микроорганизмов; он непригоден, если микроб не образует на поверхности агаризированной питательной среды или гомогенный газон определённой плотности, или газон образуется после 24-часовой инкубации бактерий, а грибов — после 48 часов.
Для реализации метода пригоден узкий круг питательных сред, зачастую не предназначенных для роста требовательных микроорганизмов. Зона подавления роста микроба не всегда адекватна его истинной чувствительности к противомикробным средствам и т.д.
Кроме того, результаты хемотаксономических тестов могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов, поэтому не являются основанием для оценки их чувствительности.
Из представленных примеров видно, что в арсенале современных бактериологических лабораторий птицефабрик должны быть методы, позволяющие идентифицировать, классифицировать и дифференцировать патогенные микроорганизмы независимо от формы или состояния.
Помимо традиционных способов определения видовой принадлежности возбудителей ассоциированных инфекций должно уделяться внимание их геномным характеристикам. Это особенно важно для тех микроорганизмов, которые претерпевают адаптивные изменения под воздействием неблагоприятных экологических факторов, антибактериальной терапии, при контакте с больной птицей и продуктами птицеводства.
Методы индикации микроорганизмов должны сочетать быстроту, специфичность, обладать функцией мультиплексности, соответствовать современному уровню развития лабораторного дела.
К таким сегодня относятся ПЦР и секвенирование чувствительности и специфичности, которые превосходят все существующие до настоящего времени хемотаксономические методы, поскольку выявляют гены (нуклеиновые кислоты) возбудителей, а не антигены и антитела.
Применение ПЦР-диагностики для выявления источника возникновения очага инфекции, выделение и изучение возбудителей инфекционных болезней (ассоциированных инфекций) как в течение эпизоотии, так и в межэпизоотический период позволит следить за изменением генетической структуры микроорганизмов, предсказывать появление новых вариантов и создавать адекватные средства защиты и диагностические препараты. Помимо этого она позволяет определять наличие возбудителя в период так называемого «серологического окна», то есть в промежутке между моментом инфицирования организма и появлением антител в количествах, достаточных для определения.
Метод ПЦР обладает рядом преимуществ перед хемотаксономическими методами. К настоящему времени материальная база для его успешного применения достаточно развита. Все её компоненты (приборы, наборы для выделения ДНК, ферменты и т.д.) широко представлены на рынке и становятся доступными по цене. Внедрение его позволит более эффективно проводить лечение и профилактику заболеваний, вызванных ассоциированными инфекциями.
Статья была опубликована в журнале «Птицеводство», 2010 год.
