Рациональная антибактериальная химиотерапия в ветеринарии

Естественный отбор на фоне широкого применения антибиотиков и синтетических противомикробных средств в гуманной и ветеринарной медицине постоянно приводит к появлению резистентных штаммов микроорганизмов. На стороне микробов – высокий потенциал наследственной изменчивости, на стороне человечества – мощь науки и ограниченные приспособительные ресурсы прокариот, к которым относятся бактерии.

Прокариоты появились на Земле около 3,5  миллиардов лет назад. Животные, как царство эукариот, - около 700 млн. лет назад. 3 миллиарда лет эволюция бактерий протекала в отсутствие других таксонов. Бактерии эволюционировали в условиях конкурентной борьбы друг с другом. Одним из видов оружия в этой борьбе явились антибиотики – природные соединения, используемые бактериями для подавления или уничтожения себе подобных. Одновременно с появлением антибиотиков у бактерии начали появляться и наследоваться способы их нейтрализации. То есть история появления резистентности бактерий к антибиотикам насчитывает миллионы, если не миллиарды лет. Поскольку все патогенные бактерии происходят от непатогенных прокариот, они, несомненно, используют закрепленную в геноме за этот гигантский период времени  информацию, позволяющую им успешно противостоять воздействию антибиотиков.

В отличие от природных антибиотиков, их модифицированные аналоги и синтетические антибактериальные средства появились, по историческим меркам, только сегодня. Сальварсан, органическое соединение мышьяка, появился в 1912 году. Пронтозил, первое синтетическое противомикробное средство из группы сульфаниламидов, - в 1935 году. Первый модифицированный антибиотик - метициллин был выпущен в 1960 году. Для нейтрализации действия синтетических препаратов бактерии не могут использовать генетический материал, накопленный за миллиарды лет эволюции, поэтому, теоретически, синтетические противомикробные препараты в меньше степени, чем антибиотики, способны приводить к селекции устойчивых штаммов бактерий.

Этот логический вывод подкрепляется экспериментальными и наблюдательными данными. Gautam Dantas, Morten O. A. Sommer и другие [1] изучили устойчивость к 18 антибиотикам 75 изолятов почвенных бактерий, принадлежащих к следующим таксонам: Burkholderiales (41%  изолятов),  Pseudomonadales (24%), Enterobacteriales (13%), Actinomycetales (7%), Rhizobiales (7%), и Sphingobacteriales (6%). Установлено, что из 18 антибиотиков, принадлежащих к 8 группам, резистентность в наименьшей степени наблюдалась к фторхинолонам, левомицетину, триметоприму, сульфаниламидам и аминогликозидам. Из 5 групп антимикробных средств, к которым бактерии были чувствительны, 3 - являются синтетическими.

Согласно широко распространенному мнению практических врачей, высокую чувствительность и медленное образование резистентности бактерии проявляют именно к синтетическим антибактериальным средствам (фторхинолонам, триметоприму, сульфаниламидам, нитрофуранам, метронидазолу), а также к полусинтетическим, химически модифицированным антибиотикам (пенициллинам, цефалоспоринам, макролидам, тетрациклинам, аминогликозидам).

Таким образом, основной способ повышения эффективности противомикробной терапии – это применение «незнакомых» для микроорганизмов, не встречающихся в природе противомикробных средств.

Классификация

Антибактериальные средства можно классифицировать по типу действия и химической структуре (см. Таб.1).

Таблица 1. Классификация антибактериальных химиотерапевтических средств.

Механизмы резистентности к антибактериальным химиотерапевтическим средствам

Резистентность микроорганизмов к антибиотикам и синтетическим антибактериальным средствам возникает путем мутаций и рекомбинаций геномов. Причем сами антибактериальные средства являются лишь фактором отбора измененных клеток.

Бактерии способны получать генетическую информацию, кодирующую резистентность, не только при вертикальной передаче от материнской клетки к дочерним, но и при горизонтальной передаче с помощью плазмид, траспозонов и вирусов, а также при конъюгации и трансформации. Потомство измененной бактериальной клетки, если эти изменения закрепились в геноме, будет устойчиво в той или иной мере к антибактериальному средству или  к целой группе таких средств, если механизм резистентности является общим для всей группы препаратов. Так возникает перекрестная устойчивость ко многим препаратам одной или даже нескольких группы. Типичный пример – перекрестная резистентность к бета-лактамным антибиотикам.

Резистентность к антибактериальным средствам обеспечивается следующими основными механизмами:

1. Предотвращение попадания антимикробного средства в клетку (левомицетин)

2. Ускорение вывода антимикробных средств из микробной клетки (фторхинолоны)

3. Разрушение или изменение антимикробного средства в клетке или во внешней среде (бета-лактамы, аминогликозиды)

4. Модификация рецептора-мишени к антимикробному средству, делающая невозможным их соединение (тетрациклины, сульфаниламиды, фторхинолоны)

5. Образование обходного метаболического пути, не блокируемого антибактериальным средством (сульфаниламиды, триметоприм)

Микроорганизмам сложнее выработать резистентность к противомикробному средству, если они используют механизм модификации рецептора-мишени, а противомикробное средство воздействует на 2 и более рецепторов. Фторхинолоны одновременно воздействуют на ДНК-гиразу и топоизомеразу IV бактерий. Частота мутаций у бактерий невысока. Например, вероятность возникновения у туберкулезных микобактерий мутаций, опосредующих устойчивость, составляет: 3,32 x 10-9 на одно деление клетки для рифампицина; 2,56 x 10-8 для изониазида; 2,29 x 10-8 для стрептомицина; 1,0 x 10-7 для этамбутола. Вероятность возникновения одновременно двух мутаций, приводящих к изменению двух рецепторов, в этом случае менее 10-15, что значительно меньше популяции бактерий в организме. Так же исчезающе мала вероятность возникновения в одной микробной клетке генетической информации, кодирующей резистентность одновременно к двум антибактериальным препаратам.  Однако со временем, с помощью горизонтального переноса генетической информации, резистентность все же может появиться.

С целью нейтрализации уже появившейся устойчивости бактерий к антибактериальным средствам используют три основных метода:

1. Химическая модификация природных антимикробных средств (например, использование полусинтетических макролидов вместо природного эритромицина)

2. Использование ингибиторов микробных ферментов, разрушающих антибиотики (например, использование пенициллинов вместе с ингибитором бета-лактамаз  - клавулановой кислотой)

3. Использование синтетических противомикробных средств, против которых у бактерий нет механизмов устойчивости

Для предотвращения появления резистентности у чувствительных штаммов микроорганизмов необходимо:

1. Не применять антимикробные препараты без явной необходимости

2. Антимикробные препараты применять в рекомендуемых дозах, выдерживая курс лечения

3. Чередовать антибактериальные препараты из разных групп

4. Комбинировать 2 или более антибактериальных препарата

Дорогая плата за резистентность

Прокариоты (см. Рис.1), к которым относятся бактерии, обладают гораздо более слабыми защитными и компенсаторными возможностями по сравнению с эукариотами, к которым относимся мы с вами. У прокариот отсутствуют митохондрии, обеспечивающие эукариот энергией. Из-за этого энергетические возможности бактерий значительно ниже. Нет эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, лизосом, клеточного ядра, отсутствует эндоцитоз. Прокариотические клетки меньше эукариотических в 100-1000 раз. Любая лишняя синтезируемая бактериями молекула ухудшает их шансы в конкурентной борьбе. Поэтому резистентные бактерии в отсутствие селекционного фактора, антимикробного препарата, постепенно вытесняются  не резистентными бактериями. Таким путем восстанавливается чувствительность штаммов бактерий по истечении определенного периода времени, когда бактерии не подвергались воздействию антибактериального препарата. По клиническим наблюдениям этот срок составляет от нескольких месяцев до нескольких лет.

Рисунок 1. Строение прокариотической клетки (цитируется на основании лицензии Creative Commons Attribution-ShareAlike)

Стратегия и тактика применения антибиотиков в ветеринарной медицине

Дезинфекция, гигиена содержания

Необходимо снизить количество патогенных бактерий во внешней среде, поскольку она, наряду с организмом животного, является резервуаром возбудителей инфекционных заболеваний. Объектом дезинфекции являются конструкционные поверхности, кормушки, поилки и прочее оборудование. Для снижения микробного загрязнения воздушной среды и создания благоприятного микроклимата важно поддерживать нормальные параметры воздухообмена, температуры, влажности и освещенности в животноводческих помещениях.

Применяем то, что эффективно

Как не парадоксально, ветеринарный врач, обслуживающий крупные хозяйства, зачастую имеет больше возможностей для постановки правильного этиологического диагноза и определения чувствительности выделенной микрофлоры к антибактериальным средствам, чем врач гуманной медицины, имеющий дело с одним пациентом и, в большинстве случаев, применяющий антимикробную терапию эмпирически, без лабораторной диагностики чувствительности к антибактериальным препаратам.

Применение эффективных против данного возбудителя препарата или препаратов – критически важно для успеха антимикробной терапии.

Существует несколько методов определения чувствительности к антибактериальным препаратам, важнейшие из которых диско-диффузный метод и метод последовательных разведений. Диско-диффузный метод дешевле и проще, но метод последовательных разведений точнее и позволяет определить минимальную ингибирующую концентрацию препарата для данного микроорганизма. Для объективной оценки чувствительности выделенной культуры бактерий к антибактериальному препарату, необходимо выполнить несколько условий. Ниже перечислены основные ошибки, приводящие к необъективному результату.

Диско-диффузный метод:

1. Завышенное или заниженное содержания антимикробного препарата в диске

2. Неверная оценка зоны задержки роста бактерий

3. Неверная интерпретация зоны задержки роста бактерий

4. Неподходящая питательная среда

Метод последовательных разведений:

1. Ошибки при изготовлении раствора антимикробного препарата (неподходящий растворитель, неполное растворение, ошибки в расчетах концентрации)

2. Неподходящая питательная среда

3. Неверная оценка роста или отсутствия роста бактерий

Объективные результаты при использовании обоих методов можно получить только при тщательной стандартизации всех этапов исследования.

Самая неочевидная, но, возможно, самая распространенная ошибка – применение неподходящей питательной среды. Поскольку катионы двухвалентных металлов отрицательно влияют на активность многих антибактериальных средств, в частности тетрациклинов и фторхинолонов [2], их содержание должно не превышать  35 мг/л для Mg2+ и 100 мг/л для   Са2+. Кроме того, концентрация тимидина  должна быть меньше 50 нг/л, поскольку тимин и тимидин препятствуют проявлению антибактериальных свойств сульфаниламидов и триметоприма. Для контроля среды на наличие антагонистов сульфаниламидных препаратов и триметоприма рекомендуется использовать штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212. При величине зоны ингибиции вокруг диска, содержащего 1.25/23.75 мкг триметоприма/сульфаметоксазола,  20 мм и более среду следует признать удовлетворительной по качеству.

Питательная среда также должна быть стерильной и подходящей для роста испытуемого штамма микроорганизмов.

Антимикробная активность in vitro и in vivo может значительно отличаться. Это связано с ошибками определения антимикробной активности в лабораторных условиях, а также с фармакокинетическими особенностями антибактериальных препаратов, в частности с их избирательным накоплением в отдельных органах и тканях, скоростью выведения и образованием метаболитов, которые могут быть более активными или менее активными, чем исходное вещество. Бывает так, что вещество, продемонстрировавшее в лабораторных условиях более высокую антибактериальную активность, после применения на животных показывает меньший терапевтический эффект, чем вещество, продемонстрировавшее in vitro меньшую активность.

Комбинированные препараты

В последнее время практические ветеринарные врачи большее внимание уделяют антимикробным средствам, содержащим 2 или 3 компонента. Это связано с большей терапевтической эффективностью таких препаратов. Если препарат применяется «в слепую», без определения чувствительности выделенных патогенных штаммов к компонентам препарата, то вероятность получить ожидаемый эффект возрастает в 2-3 раза. Если препарат применяется после определения чувствительности, то, врач закономерно ожидает усиление эффекта, что может даже служить основанием к снижению дозы.

Усиление эффекта, то есть синергизм, имеет место не при всех сочетаниях антимикробных препаратов. Сочетание бактерицидных антибиотиков, действующих в момент деления микробной клетки, с бактериостатическими препаратами (например, бензилпенициллина с сульфаниламидом) приводит к снижению эффекта. Суммационный синергизм, при котором эффект от сочетания равен сумме эффектов, встречается при сочетании препаратов, принадлежащих к одной группе антимикробных средств, обладающих одним механизмом действия (например, сочетание бензилпенициллина и оксациллина). Потенцированный синергизм, при котором эффект от сочетания больше, чем простая сумма эффектов, встречается при сочетании препаратов с разным механизмом действия. Одним из примеров такого удачного сочетания является препарат «Трифлон», содержащий энрофлоксацин и триметоприм. Энрофлоксацин - противомикробное средство широкого спектра действия из группы фторхинолонов. Механизм действия связан с угнетением бактериальной ДНК-гиразы, что приводит к нарушению репликации ДНК бактерий. Триметоприм - противомикробное средство широкого спектра действия из группы диаминопиримидинов.  Механизм его действия связан с угнетением бактериальной редуктазы дигидрофолиевой кислоты. Бактериальная дигидрофолатредуктаза  в 50-100 тысяч раз чувствительнее к триметоприму, чем у животных и человека. Триметоприм блокирует один из этапов синтеза нуклеиновых кислот - образование тетрагидрофолиевой кислоты из дигидрофолиевой, которая является субстратом для синтеза нуклеиновых кислот бактерий. Таким образом, оба препарата у микробов действуют на разные звенья одного и того же процесса - синтеза нуклеиновых кислот, что является предпосылкой для проявления потенцированного синергизма.

При сочетании антибактериальных средств химиотерапевтического действия важно учитывать фармакокинетические параметры компонентов, которые должны обладать примерно одинаковым периодом полувыведения и проникать в места локализации возбудителя. И триметоприм и энрофлоксацин, вследствие своей высокой липотропности, способны проникать в труднодоступные для более гидрофильных веществ  места, создавать там достаточные для проявления выраженного антибактериального действия концентрации.

Предотвращение инактивации антибактериальных средств

Некоторые антибактериальные химиотерапевтические средства чувствительны к ингибирующим факторам внешней среды.

Биодоступность тетрациклинов  и фторхинолонов резко снижается в присутствие ионов кальция, магния, железа, меди, свинца. Изменение рН среды в сторону от оптимальной снижает биодоступность макролидов и фторхинолонов, разрушает пенициллины. Фотодеградации под действием солнечного света подвержены фторхинолоны. Сульфаниламиды теряют свою активность при назначении с новокаином. Пенициллины неустойчивы при повышенной температуре.

Для предотвращения физической или химической инактивации антибиотиков следует применять их не в виде чистых субстанций,  а в виде готовых лекарственных препаратов, содержащих вещества, предотвращающие инактивацию в корме или питьевой воде. Необходимо также оберегать антибиотики от ионов металлов, помещая в неметаллическую посуду и использовать для приготовления растворов нежесткую воду, в идеале - дистиллированную воду.

Для предотвращения инактивации бета-лактамных антибиотиков (пенициллинов и цефалоспоринов) бета-лактамазами микроорганизмов полезно сочетание их с ингибиторами бета-лактамаз (клавулановой кислотой, сульбактамом,  тазобактамом).

Сохранение нормальной микрофлоры

Важной задачей во время антибактериальной химиотерапии является сохранение нормальной микрофлоры организма животного. Нарушения нормального микробного биоценоза, особенно биоценоза кишечника, приводит к дисбактериозу – состоянию, когда нормальная микрофлора замещается необычной, либо когда обычная микрофлора локализуется в необычных для себя местах. Типичным примером дисбактериоза является замещение нормальной микрофлоры кишечника грибками рода Candida или анаэробами рода Clostridia.  Соответственно развивается кандидоз или некротический энтерит.

Для предотвращения развития дисбактериоза следует применять антибиотики узкого спектра действия, что в реальной жизни вступает в противоречие с задачей, которую решает врач при невыясненной этиологии возбудителя. В гуманной медицине давно установлено, что чаще всего дисбактериоз вызывают такие антибиотики, как левомицетин, тетрациклины, клиндамицин. В ветеринарии отмена кокцидиостатических антибиотиков – ионофоров иногда приводит к возникновению некротического энтерита.

Если есть возможность, необходимо использовать антибактериальный препарат не системного, а локального действия, например, колистин, который не всасывается в кишечнике и действует только в его просвете.  Местно на коже и слизистых оболочках следует вместо антибиотиков применять антисептики, к которым у микроорганизмов резистентность почти не вырабатывается.

Дисбактериоз, вызванный одним антибактериальным препаратом, нередко приходится лечить с применением другого препарата, влияющего на замещенную микрофлору.

Фармакокинетические особенности действия антибактериальных препаратов

Из фармакокинетических параметров антибактериальных средств для практического врача имеют значение такие параметры, как биодоступность, накопление в определенных органах и тканях, период полувыведения и пути выведения препарата.

Биодоступность, то есть степень всасывания препарата, отражает долю препарата, поступившую в кровь. Биодоступность зависит, прежде всего, от химической природы вещества, размеров его частиц (чем меньше, тем выше биодоступность), лекарственной формы, наличия вспомогательных веществ, вида животного, свойств воды или корма, а также состояния кишечника  (при оральном пути введения). Выше говорилось о влиянии ионов металлов на биодоступность. При оральном введении большое значение имеет состояние кишечника. При поносах поступившие с водой или кормом антибактериальные средства могут не успеть всосаться слизистой оболочкой кишечника и не оказать свое действие.

Липофильные, хорошо растворимые в жирах вещества способны легко проникать через мембраны клеток и создавать в органах и тканях высокие концентрации, значительно большие, чем в крови. К таким препаратам относятся триметоприм, фторхинолоны, макролиды. Например, тилмикозин, макролидный антибиотик, накапливается  у птиц в тканях легких и воздухоносных мешков в концентрации, превышающей концентрацию в крови соответственно 25 раз и в 16 раз [3]. Гидрофильные вещества, к которым относятся пенициллины и цефалоспорины, хуже проникают через клеточные барьеры и поэтому более эффективны при септицемии, чем при внутриклеточных инфекциях. Амфифильные вещества, к которым относятся фторхинолоны, проявляют смешанные свойства.

Период полувыведения препарата, то есть время, в течение которого его концентрация падает в 2 раза, необходимо учитывать при расчете периодичности дачи препарата. Увеличение периода дачи препарата сверх рекомендуемого приводит к снижению терапевтической эффективности и возрастанию риска развития резистентности. Распространенной ошибкой является введение суточной дозы препаратов, имеющих период полувыведения 6-12 часов (например, энрофлоксацина), с питьевой водой в течение рабочего дня, то есть за 8 часов. При этом концентрация энрофлоксацина в течение оставшихся до следующего введения 6-8 часов ниже минимальной ингибирующей концентрации.

Пути выведения препарата следует учитывать с целью достижения высокой концентрации препарата в месте локализации патогенных микроорганизмов. Например, гентамицина сульфат практически не всасывается в кровь при оральном введении и выводится с калом. При оральном введении гентамицин эффективен против желудочно-кишечных патогенов, а при инъекционном пути введения – при заболеваниях мочевыводящих путей, поскольку, в этом случае,  на 90% выводится с мочой.             

В случае локализации возбудителя на коже и слизистых оболочках успешная антимикробная терапия бывает, как правило, тогда, когда химиотерапевтическое средство действует через кровь «изнутри» организма, а антисептик – снаружи, со стороны кожи или слизистой оболочки. Одностороннее воздействие часто неэффективно.

Трудная для практического врача ситуация может возникнуть при локализации возбудителя на поверхности труднодоступных слизистых оболочек дыхательных путей и мочеполовых органов, когда не удается уничтожить возбудителя применяя только системный антимикробный препарат, а антисептик невозможно применить из-за анатомических особенностей.

Применение пробиотиков и пребиотиков

Применение пробиотиков (сапрофитных микроорганизмов)  и  пребиотиков (веществ, стимулирующих рост нормальной микрофлоры), а также кислот, ограничивающих рост патогенной микрофлоры, не может рассматриваться, как альтернатива антибактериальной химиотерапии. Вытеснить патогенную микрофлору, особенно в желудочно-кишечном тракте, без химиотерапевтических препаратов очень непросто. Гораздо большую перспективу имеет применение пробиотиков в период химиотерапии, если пробиотический микроорганизм нечувствителен к действию химиотерапевтического средства (например, Saccharomyces cerevisiae) или непосредственно после неё. Это позволяет не допустить развитие патогенной микрофлоры до того времени, пока начнет восстанавливаться нормальная микрофлора животного.  Кроме того, пробиотики довольно дороги.

Органические кислоты активно используются в виде кислот или солей в птицеводстве и свиноводстве. К наиболее эффективным препаратам относится муравьиная кислота и ее соли.

Считаем деньги

В конечном итоге ветеринарная медицина, за исключением антропозоонозных инфекций, руководствуется принципом экономической целесообразности. На первом месте стоит себестоимость продукции. Поэтому практические врачи стремятся получить максимум терапевтической или профилактической эффективности за минимум денег.

От цены антибактериального препарата напрямую не зависит себестоимость продукции, поскольку необходимо учитывать ряд других факторов: периодичность и продолжительность лечения, трудозатраты на антибактериальную терапию, возможность возникновения рецидивов, период ожидания после применения препарата, когда нельзя использовать продукцию от животного, возможность возникновения резистентных штаммов микроорганизмов, влияние на продуктивность и качество животноводческой продукции. Нередко более дорогой препарат за счет большей эффективности или за счет меньшей курсовой дозы оказывается экономически более выгодным, чем более дешевый.

Литература

1. Gautam Dantas, Morten O. A. Sommer, Rantimi D. Oluwasegun, George M. Church. Bacteria Subsisting on Antibiotics.- Science.-320.-2008.- р.100-103

2. Забелина И.К. Влияние жесткой воды на биодоступность энрофлоксацина у бройлеров. Цит. по http://www.webpticeprom.ru/ru/articles-maintenance.html?pageID=1232783542.

3. Warren M.J. et.al. Vet Pharmacol. Therap.- 20 (Supl.1).- 1997.- 181-218