Изменения в процессах ремоделирования костной ткани, повреждения хрящей и апоптоза у бройлеров с некрозом головки бедренной кости

Некроз головки бедренной кости (НГБК) является серьезным заболеванием скелета у мясных кур, приводящим к хромоте и значительным экономическим потерям. Изначально считавшийся преимущественно инфекционным заболеванием, в настоящее время НГБК рассматривается как мультифакторная патология, в развитии которой ключевую роль играют неинфекционные факторы, такие как ишемия, механический стресс и иммуносупрессия. В данном обзоре, основанном на оригинальном исследовании, рассматриваются изменения процессов ремоделирования костной ткани, деградации хряща и механизмов апоптоза у бройлеров со спонтанным НГБК. Показано, что, хотя нарушения костного метаболизма (снижение минеральной плотности, дисбаланс между формированием и резорбцией кости) являются системными, наиболее ранние и выраженные патологические изменения наблюдаются в хрящевой ткани. Ключевым звеном патогенеза является гиперэкспрессия фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1α), которая запускает каскад реакций, ведущих к хроническому стрессу эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и, как следствие, к апоптозу хондроцитов. Результаты исследований in vivo и in vitro с использованием глюкокортикоидной модели (метилпреднизолон) подтверждают, что активация оси HIF-1α/ERS/CHOP является критическим механизмом повреждения хряща при НГБК. Полученные данные позволяют предположить, что таргетное воздействие на сигнальный путь HIF-1α может открыть новые перспективы для профилактики и лечения данной патологии.

Введение

Болезни конечностей у бройлеров остаются одной из наиболее острых проблем современного птицеводства, нанося значительный экономический ущерб из-за выбраковки птицы, снижения привесов и ухудшения благополучия животных. Среди них некроз головки бедренной кости, проявляющийся хромотой различной степени тяжести, занимает особое место ввиду высокой распространенности при интенсивных методах выращивания.

Долгое время считалось, что основным этиологическим фактором НГБК являются бактериальные инфекции, в частности, вызываемые Staphylococcus aureus. Однако накопленные данные последних десятилетий убедительно доказали, что неинфекционные факторы играют не менее, а возможно, и более важную роль в инициации заболевания. К ним относятся ишемия головки бедренной кости, механический стресс, обусловленный сверхбыстрым ростом мышечной массы, дисбаланс липидного обмена и иммуносупрессия, вызванная повышением уровня кортикостерона. Для изучения стерильных форм остеонекроза была успешно применена модель, индуцированная глюкокортикоидами.

Качество костной ткани является критическим фактором, определяющим резистентность скелета к нагрузкам. Предыдущие исследования продемонстрировали ухудшение минеральной плотности и биомеханических свойств костей у бройлеров с НГБК. Однако, учитывая, что головка бедренной кости покрыта суставным хрящом, который первым принимает на себя нагрузку, изучение состояния хрящевой ткани представляет не меньший, а возможно, и больший интерес. Было установлено, что повреждение хряща при НГБК тесно связано с апоптозом хондроцитов и нарушением гомеостаза внеклеточного матрикса.

Апоптоз может запускаться как внешними, так и внутренними сигналами. Одним из ключевых внутренних механизмов является стресс эндоплазматического ретикулума. Накопление неправильно свернутых белков в полости ЭПР активирует сигнальные пути unfolded protein response (UPR), опосредованные тремя основными сенсорами: ATF6, IRE1 и PERK. В норме UPR направлен на восстановление гомеостаза, однако при хроническом или чрезмерном стрессе эти же пути инициируют апоптоз через активацию эффекторных молекул, таких как транскрипционный фактор CHOP.

Кроме того, хрящевая ткань в физиологических условиях находится в состоянии гипоксии. Ключевым регулятором клеточного ответа на гипоксию является фактор HIF-1α. В условиях патологии, усугубляющей гипоксию, HIF-1α может оказывать двоякое действие. Существуют данные о его взаимодействии с сигнальными путями ЭПР, что позволяет предположить его роль в запуске апоптоза хондроцитов при НГБК.

Целью данного исследования являлось комплексное изучение изменений ремоделирования костной ткани и повреждения хряща у бройлеров с разной степенью тяжести спонтанного НГБК, а также выявление роли HIF-1α и ERS-опосредованного апоптоза в патогенезе заболевания.

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач был проведен комплексный эксперимент, включающий in vivo и in vitro этапы.

Дизайн эксперимента in vivo. Объектом исследования послужили шестинедельные бройлеры кросса Росс 308, выращенные в стандартных условиях на одной из ферм провинции Цзянсу (Китай). В зависимости от состояния головки бедренной кости, оцененного в соответствии с утвержденными критериями, птица была разделена на три группы: 1) клинически здоровая (норма); 2) с отслоением эпифиза головки бедренной кости без повреждения зоны роста (FHS); 3) с отслоением эпифиза и разрывом зоны роста (FHSL). Степень повреждения хрящевой ткани дополнительно оценивали по шкале Международного общества по восстановлению хряща (ICRS). В каждой группе для анализа было отобрано по 6 голов.

Методы лабораторного анализа. У всей птицы оценивали живую массу, массу иммунных органов (селезенка, тимус, фабрициева сумка), рассчитывая их индексы. В сыворотке крови определяли концентрацию кортизола методом ИФА. Биохимический анализ сыворотки включал определение уровней кальция, фосфора, креатинина и общей щелочной фосфатазы. Специфические маркеры костного ремоделирования (остеокальцин (ОТ), костная щелочная фосфатаза (BALP), C-концевой телопептид коллагена I типа (CTX-I) и тартрат-резистентная кислая фосфатаза 5b (TRACP-5b)) также определяли методом ИФА. Оценка минеральной плотности костной ткани головки бедренной кости и биомеханических параметров бедренной кости проводилась с использованием стандартизированных методов.

Для гистологического анализа образцы головки бедренной кости фиксировали в 4% параформальдегиде, декальцинировали в ЭДТА-растворе и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (H&E), альциановым синим, толуидиновым синим и сафранином О для оценки структуры хряща и матрикса. Апоптоз в хрящевой ткани выявляли методом TUNEL с использованием флуоресцентной метки, с последующей количественной оценкой интенсивности свечения в программе ImageJ. Уровень экспрессии генов, связанных со стрессом ЭПР (BIP, ATF6, IRE1, PERK, CHOP), апоптозом (BID, BCL2, каспаза-3) и гипоксией (HIF-1α) в хрящевой ткани оценивали методом количественной ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР). Иммуногистохимический анализ использовали для локализации и полуколичественной оценки экспрессии белка каспазы-3 и HIF-1α.

Эксперименты in vitro. Для подтверждения полученных данных была создана клеточная модель. Первичные хондроциты выделяли из проксимального отдела большеберцовой кости бройлеров. Культуру клеток второго пассажа использовали в экспериментах. Для индукции повреждения, аналогичного НГБК, клетки обрабатывали метилпреднизолоном (МП) — синтетическим глюкокортикоидом. Для изучения роли стресса ЭПР использовали его ингибитор салубринал (SA) и активатор туникамицин (TM). Для модуляции экспрессии HIF-1α клетки трансфицировали плазмидой со сверхэкспрессией гена *HIF-1α* (oeHIF-1α) или малой интерферирующей РНК (siRNA), направленной на подавление его экспрессии. Уровень апоптоза в культуре оценивали методом проточной цитометрии с двойным окрашиванием аннексином V-FITC и пропидием йодидом. Экспрессию целевых белков (HIF-1α, компонентов путей UPR и каспазы-3) подтверждали методом вестерн-блоттинга.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения SPSS. Различия между группами оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с пост-хок тестом Тьюки. Корреляционный анализ выполняли с использованием критериев Пирсона или Спирмена. Различия считали статистически значимыми при P < 0,05.

Результаты исследования

Состояние иммунной системы и костного метаболизма при спонтанном НГБК.

Клиническая картина НГБК варьировала от легкой хромоты до полной обездвиженности птицы. Было отмечено, что бройлеры с признаками НГБК имели тенденцию к снижению живой массы, что, вероятно, связано с ограниченным доступом к корму и воде. Наряду с этим, у птицы с тяжелой формой (FHSL) наблюдалось незначительное уменьшение индексов иммунных органов (селезенки, тимуса и фабрициевой сумки) и достоверное повышение уровня кортизола в сыворотке крови по сравнению со здоровыми особями. Это указывает на наличие иммуносупрессивного состояния, усугубляющегося по мере прогрессирования заболевания.

Анализ костного метаболизма выявил ряд важных закономерностей. Минеральная плотность костной ткани головки бедренной кости была достоверно снижена только у бройлеров группы FHSL, у которых зафиксирован эпифизарный перелом. Биомеханические испытания бедренной кости показали аналогичную картину: значимое ухудшение прочностных характеристик (жесткость, модуль упругости, предел прочности и др.) наблюдалось исключительно в группе FHSL. Однако биохимический анализ сыворотки крови продемонстрировал, что нарушения метаболизма костной ткани начинаются на более ранних стадиях. У бройлеров обеих групп с НГБК (FHS и FHSL) было обнаружено повышение соотношения кальций/фосфор, что косвенно свидетельствует о деминерализации. При этом уровни маркеров костеобразования (ОТ и BALP) были снижены, а маркеров резорбции (CTX-I и TRACP-5b) — повышены. Таким образом, системный дисбаланс в процессах ремоделирования кости (подавление формирования и усиление резорбции) присутствует уже на начальных этапах НГБК, однако критические изменения структуры и прочности кости развиваются лишь при достижении заболеванием крайней степени тяжести (FHSL).

Дегенерация хрящевой ткани как ранний маркер НГБК.

В отличие от костной ткани, хрящ демонстрировал четкую корреляцию степени повреждения с тяжестью НГБК. Оценка по шкале ICRS показала, что в группе FHS преобладали поверхностные повреждения (1-2 степень), тогда как у птиц с FHSL большая часть хряща имела глубокие дефекты, распространяющиеся на субхондральную кость (3-4 степень). Гистологическое исследование подтвердило эти данные. Окраска срезов выявила истончение и повреждение блестящей пластинки (lamina splendens) поверхностной зоны хряща, а также наличие интрацитоплазматических вакуолей и пикнотических ядер в хондроцитах. Степень выраженности этих изменений нарастала от группы FHS к группе FHSL.

Активация апоптоза и стресса ЭПР.

TUNEL-окрашивание продемонстрировало достоверное увеличение количества апоптотических хондроцитов в хрящевой ткани бройлеров с НГБК, причем наиболее высокий уровень апоптоза регистрировался в группе FHSL. Эти данные коррелировали с повышенной экспрессией мРНК проапоптотического гена BID и эффекторной каспазы-3, а также с результатами иммуногистохимического выявления белка каспазы-3.

Анализ экспрессии генов сигнальных путей ЭПР показал, что у бройлеров с НГБК происходит значительная активация всех трех сенсоров UPR (IRE1, PERK, ATF6) и их эффекторов. Ключевым наблюдением стало резкое повышение уровня мРНК и белка фактора транскрипции CHOP, являющегося центральным медиатором ERS-индуцированного апоптоза. Уровень активации этих генов был максимальным в группе FHSL, что указывает на прямую связь между хроническим стрессом ЭПР, апоптозом хондроцитов и тяжестью дегенерации хряща.

Ключевая роль HIF-1α.

Учитывая физиологическую гипоксию хряща, была исследована экспрессия HIF-1α. У бройлеров с НГБК наблюдалось значительное повышение уровня мРНК и белка HIF-1α в хрящевой ткани, причем наиболее выраженное — в группе FHSL. Корреляционный анализ выявил сильную положительную связь между уровнем экспрессии HIF-1α, тяжестью НГБК (по шкале ICRS) и интенсивностью апоптоза хондроцитов (TUNEL-позитивные клетки, экспрессия каспазы-3). Эти результаты позволили предположить, что HIF-1α является ключевым регулятором патологических процессов в хряще при НГБК.

Подтверждение механизма в модели in vitro.

Обработка первичных культур хондроцитов метилпреднизолоном приводила к дозозависимому снижению их пролиферации и значительному увеличению апоптоза, что подтверждено данными проточной цитометрии (уровень апоптоза достигал ~19%). В обработанных МП клетках, так же как и в хряще бройлеров с НГБК, наблюдалась активация HIF-1α и ключевых генов стресса ЭПР.

Использование фармакологических модуляторов подтвердило причинно-следственную связь. Активатор ЭПР туникамицин вызывал повышение уровня апоптоза хондроцитов, тогда как ингибитор ЭПР салубринал, напротив, снижал цитотоксический эффект МП, подавляя экспрессию генов UPR и апоптоза. Эти данные подтвердили, что МП индуцирует гибель клеток именно через активацию сигнального пути ЭПР.

HIF-1α как регулятор ERS-зависимого апоптоза.

Для выяснения роли HIF-1α была проведена его искусственная сверхэкспрессия в хондроцитах с помощью плазмиды (oeHIF-1α). Это привело к значительному повышению уровня апоптоза (до ~20%), сопоставимому с действием МП. Сверхэкспрессия HIF-1α активировала все три ветви UPR (повышая уровни IRE1, PERK, ATF6 и CHOP) и проапоптотические гены (BID, каспаза-3). Интересно, что комбинированное воздействие (oeHIF-1α + МП или oeHIF-1α + ТМ) приводило к еще более выраженному апоптозу. Напротив, подавление синтеза HIF-1α с помощью специфической siRNA значительно снижало апоптоз, индуцированный МП, и уменьшала экспрессию генов, связанных со стрессом ЭПР. Это доказывает, что HIF-1α находится выше в сигнальном каскаде и его активация необходима для запуска ERS-опосредованной гибели хондроцитов.

Обсуждение

Проведенное исследование вносит важный вклад в понимание патогенеза некроза головки бедренной кости у бройлеров, демонстрируя переход от инфекционной теории к мультифакторной модели, где центральную роль играют метаболические и клеточные нарушения. Полученные данные подтверждают, что стресс, вызванный факторами внешней среды и быстрым ростом, приводит к повышению уровня кортикостерона, что в свою очередь вызывает иммуносупрессию и создает благоприятный фон для развития костно-суставной патологии.

Ключевым выводом работы является демонстрация того, что, несмотря на системные нарушения костного метаболизма, наиболее ранние и информативные изменения при НГБК происходят в хрящевой ткани. Хотя дисбаланс в процессах ремоделирования кости (снижение формирования и усиление резорбции) является общим фоном, критические структурные повреждения самой кости возникают лишь на терминальной стадии, сопровождающейся переломом. В то же время дегенерация хряща прогрессирует параллельно с утяжелением клинических проявлений, что делает его идеальной тканью для изучения механизмов развития заболевания.

Центральным звеном этого процесса является индукция апоптоза хондроцитов. Наше исследование впервые комплексно демонстрирует, что этот апоптоз опосредован хронической активацией сигнальных путей стресса эндоплазматического ретикулума. Повышение экспрессии CHOP, ключевого проапоптотического фактора UPR, в хряще бройлеров с НГБК и в клеточной модели указывает на то, что именно неспособность ЭПР справиться с накоплением неправильно свернутых белков (ERS) переключает клетку с адаптивного ответа на программу гибели.

Наиболее важным открытием является установление роли HIF-1α как главного регулятора этого процесса. Физиологическая гипоксия хряща усугубляется при НГБК, вероятно, из-за ишемии и нарушения микроциркуляции. Это приводит к гиперэкспрессии и стабилизации HIF-1α. Полученные нами данные убедительно доказывают, что повышенный уровень HIF-1α напрямую активирует все три ветви UPR, запуская каскад, кульминацией которого является ERS-зависимый апоптоз. Сильная корреляция между уровнем HIF-1α, тяжестью НГБК и степенью апоптоза хондроцитов, а также результаты экспериментов со сверхэкспрессией и сайленсингом гена, подтверждают, что именно HIF-1α является триггером этого патологического каскада.

Таким образом, патогенез НГБК можно представить следующим образом: ишемия и другие стрессовые факторы (в т.ч. глюкокортикоиды) приводят к гиперэкспрессии HIF-1α в хондроцитах. HIF-1α вызывает хроническую активацию сигнальных путей стресса ЭПР (UPR), что, в свою очередь, через активацию фактора CHOP запускает необратимый апоптоз клеток хряща. Гибель хондроцитов и нарушение ими синтеза внеклеточного матрикса ведут к дегенерации и механической несостоятельности хряща, что в конечном итоге при продолжающихся нагрузках может привести к отслоению эпифиза и переломам субхондральной кости.

Заключение

В заключение, данное исследование демонстрирует, что некроз головки бедренной кости у бройлеров характеризуется комплексными нарушениями гомеостаза как костной, так и хрящевой тканей. Однако повреждение хрящевой ткани является более чувствительным маркером и прогрессирует по мере утяжеления патологии. Ключевым молекулярным механизмом, лежащим в основе этого повреждения, является гиперэкспрессия фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1α). Повышенный уровень HIF-1α в хондроцитах запускает каскад реакций, приводящих к хроническому стрессу эндоплазматического ретикулума, активации проапоптотического фактора CHOP и, в конечном итоге, к гибели клеток. Полученные данные позволяют рассматривать HIF-1α и связанные с ним сигнальные пути (ERS/CHOP) в качестве перспективных терапевтических мишеней для разработки новых стратегий профилактики и лечения некроза головки бедренной кости у птицы, направленных на защиту хрящевой ткани от преждевременной дегенерации.