Регулирующее воздействие флавоноидов из листьев боярышника и стевиозида на функцию матки и качество яичной скорлупы у кур-несушек

Яйцо является ценнейшим источником жирных кислот, витаминов, минералов и высококачественного белка, играющим важную роль в питании человека. Однако его пищевая и экономическая ценность часто снижается из-за повреждений скорлупы, особенно в конце продуктивного периода. Эта проблема связана с длительной яйцекладкой, которая приводит к старению яйцевода, метаболическим нарушениям и гипоплазии скорлуповой железы, что в итоге негативно сказывается на прочности скорлупы. Ключевыми факторами, влияющими на здоровье репродуктивного тракта птицы и качество яйца, также являются окислительный стресс и воспалительные процессы. В связи с этим, разработка эффективных стратегий кормления, направленных на регуляцию работы яйцевода и улучшение качества скорлупы, имеет решающее значение для повышения рентабельности производства и увеличения сроков хранения продукции.

Формирование яичной скорлупы — это сложный, строго регулируемый процесс, в котором задействованы как генетические, так и физиологические механизмы. Минерализация скорлупы включает транспорт и взаимодействие множества ионов, которые под контролем белков матрикса формируют многоуровневую структуру. Транскриптомный анализ показывает, что старение влияет на экспрессию генов, отвечающих за транспорт кальция, что в свою очередь нарушает его поглощение и доставку. Известно, что способность усваивать кальций напрямую коррелирует с прочностью и толщиной скорлупы. Основное количество ионов кальция поступает с кормом через двенадцатиперстную кишку. У старых кур-несушек эффективность этого процесса снижается из-за изменений проницаемости и структуры кишечника. Немаловажную роль играет и кишечная микробиота, дисбаланс которой может негативно влиять на общее здоровье и продуктивность птицы. Более того, микроорганизмы из кишечника могут колонизировать репродуктивный тракт, оказывая положительное влияние на яйценоскость и качество яиц.

Флавоноиды листьев боярышника (ФЛБ) представляют собой биоактивные соединения, обладающие широким спектром полезных свойств, включая противовоспалительное, антиоксидантное и антибактериальное действие. Исследования показывают, что добавление ФЛБ в рацион стареющих кур-несушек улучшает яйценоскость и снижает окислительный стресс в репродуктивных органах. Другой компонент, стевиозид (СТ), является дитерпеновым гликозидом, извлекаемым из стевии. В организме он метаболизируется кишечными микроорганизмами до стевиола, который затем усваивается. Стевиозид способен регулировать различные биологические функции: уменьшать воспаление, смягчать последствия окислительного стресса и влиять на метаболизм кальция. Добавление СТ в корм для стареющих кур-несушек также улучшает яйценоскость и качество скорлупы за счет повышения содержания кальция и антиоксидантной защиты в матке. Кроме того, экстракт стевии изменяет состав микробиоты кишечника, увеличивая ее разнообразие, что положительно сказывается на здоровье птицы.

Большинство современных исследований сосредоточено на изучении эффектов отдельных растительных добавок. Однако стоимость ФЛБ значительно ниже по сравнению с другими флавоноидами, а их действие в сочетании со стевиозидом может быть взаимодополняющим и экономически выгодным. Исходя из этого, целью данной работы стало изучение регуляторных механизмов совместного добавления ФЛБ и стевиозида на качество яичной скорлупы и функцию матки яйцевода у кур-несушек с использованием транскриптомных и микробиомных методов.

Материалы и методы

Исследование проводилось на 630 здоровых курах-несушках (кросс «Jing Tint 6») в возрасте 66 недель. Птицу случайным образом разделили на 7 групп, по 6 повторений в каждой. В течение двухнедельного подготовительного периода всех кур кормили стандартным кормом. Основной 8-недельный эксперимент включал контрольную группу (CON), получавшую базовый рацион, и шесть опытных групп, в рацион которых добавляли различные комбинации ФЛБ и стевиозида. Были изучены дозировки: 120 мг/кг ФЛБ (HF120), 120 мг/кг СТ (ST120), а также их комбинации: 120 мг/кг ФЛБ + 120 мг/кг СТ (HF120+ST120), 120 мг/кг ФЛБ + 60 мг/кг СТ (HF120+ST60), 60 мг/кг ФЛБ + 120 мг/кг СТ (HF60+ST120) и 60 мг/кг ФЛБ + 60 мг/кг СТ (HF60+ST60). Выбор доз основывался на предыдущих исследованиях, показавших эффективность и безопасность этих концентраций. Условия содержания (световой режим, влажность, доступ к корму и воде) были стандартными для всех групп.

По окончании эксперимента собирали образцы яиц для оценки их качества, механических свойств и ультраструктуры скорлупы. У кур отбирали пробы крови, а также образцы тканей матки и двенадцатиперстной кишки для гистологического, биохимического и молекулярно-генетического анализов. В тканях матки оценивали антиоксидантную активность и уровень провоспалительных цитокинов. С помощью методов транскриптомики (RNA-Seq) анализировали экспрессию генов, а с помощью секвенирования 16S рРНК — состав микробиоты матки. Статистическую обработку данных проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия.

Результаты

Продуктивные показатели. Статистически значимых различий по основным показателям (яйценоскость, средняя масса яйца, потребление корма и конверсия корма) между группами выявлено не было. Однако анализ динамики количества битых яиц и яиц с мягкой скорлупой показал, что к 8-й неделе эксперимента в опытных группах наблюдалось численное снижение этих показателей. Наилучший результат продемонстрировала группа HF120+ST120, где количество битых яиц и яиц с мягкой скорлупой снизилось на 0,47% и 0,27% соответственно. В то время как в контрольной группе доля бракованных яиц линейно увеличивалась со временем, в группе HF120+ST120 наблюдалась обратная тенденция.

Механические свойства и толщина скорлупы. Добавление ФЛБ и стевиозида значительно повысило прочность яичной скорлупы на разрыв. В группе HF120+ST120 также было отмечено значительное увеличение толщины скорлупы. Показатель вязкости разрушения (трещиностойкости) был значительно выше в группах HF120+ST120 и HF120+ST60, причем наилучший эффект наблюдался при комбинации 120 мг/кг обоих компонентов.

Ультраструктура скорлупы. Анализ ультраструктуры показал, что добавка HF120+ST120 значительно увеличила толщину и долю эффективного слоя скорлупы, который является основным несущим слоем, ответственным за ее прочность. При этом доля сосочкового (маммиллярного) слоя была снижена. Частота раннего слияния маммил (сосочков), что является признаком структурного совершенства скорлупы, в группе HF120+ST120 была значительно выше, чем в контроле. Также было отмечено снижение количества аномальных маммил типа B, которые являются зонами потенциального распространения трещин.

Содержание кальция и фосфора. Уровень кальция в сыворотке крови был значительно выше в группе HF120+ST120 по сравнению с контролем. Содержание кальция и фосфора в тканях матки достоверно не различалось между группами.

Морфология тканей. В двенадцатиперстной кишке добавки ФЛБ и СТ привели к значительному увеличению высоты ворсинок и соотношения высоты ворсинок к глубине крипт, что свидетельствует об улучшении всасывательной способности. В матке было отмечено значительное увеличение высоты складок слизистой оболочки в группах ST120 и HF120+ST120. Экспрессия мРНК ключевых генов-переносчиков кальция в двенадцатиперстной кишке (CALB1, ATP2B1, SLC8A3) была значительно выше в группе HF120+ST120.

Транскриптомный анализ матки. Сравнение групп CON и HF120+ST120 выявило 1617 дифференциально экспрессируемых генов. Анализ обогащения показал, что эти гены участвуют в биологических процессах, связанных с транспортом ионов, развитием тканей, клеточной адгезией и межклеточной сигнализацией. Среди молекулярных функций было отмечено связывание с ионами кальция. Анализ сигнальных путей KEGG выявил значительное обогащение по путям MAPK, фокальной адгезии и кальциевому сигнальному пути. Среди генов с повышенной экспрессией были идентифицированы 13 генов-переносчиков, связанных с минерализацией скорлупы (включая CALB1, ATP2B1, CA4), и 5 генов, кодирующих матриксные белки (такие как SPP1, CLU, MEPE), которые играют ключевую роль в формировании кристаллической структуры скорлупы.

Антиоксидантная и противовоспалительная защита. В группе HF120+ST120 были значительно выше общая антиоксидантная способность и активность глутатионпероксидазы в матке, а также уровень противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-10). Уровень малонового диальдегида, маркера окислительного стресса, был значительно ниже. Корреляционный анализ показал, что экспрессия генов-переносчиков (CALB1, CLU) отрицательно коррелирует с уровнем окислительного стресса и положительно — с уровнем антиоксидантной защиты.

Микробиота матки. Секвенирование 16S рРНК выявило значительное увеличение альфа- и бета-разнообразия микробиоты в группе HF120+ST120. На уровне типов было отмечено снижение доли Proteobacteria (включающих многие патогены) и увеличение доли Bacteroidetes. На уровне родов в группе HF120+ST120 было ниже содержание Lactobacillus и Mycoplasma, но выше содержание Bacteroides, Rikenellaceae_RC9_gut_group и Ruminococcus. Корреляционный анализ показал, что обилие Bacteroidetes, Ruminococcus и Rikenellaceae_RC9_gut_group положительно коррелировало с ключевыми показателями качества скорлупы (толщина, прочность, частота раннего слияния маммил) и уровнем противовоспалительных цитокинов, в то время как обилие Proteobacteria имело противоположные корреляции.

Обсуждение

Проведенное исследование продемонстрировало, что добавление флавоноидов листьев боярышника и стевиозида, особенно в комбинации по 120 мг/кг каждого, оказывает комплексное положительное влияние на качество яичной скорлупы у кур-несушек в поздний период яйцекладки. Хотя значимого влияния на общую яйценоскость выявлено не было, наблюдалась четкая тенденция к снижению количества дефектных яиц, что указывает на улучшение именно качества скорлупы.

Положительный эффект на механические свойства скорлупы был подтвержден на ультраструктурном уровне. Увеличение толщины и доли эффективного слоя, а также оптимизация структуры сосочкового слоя (повышение частоты раннего слияния маммил и снижение числа аномальных маммил типа B) привели к повышению прочности и трещиностойкости. Эти изменения связаны с улучшением процессов биоминерализации, которые зависят от транспорта ионов и активности матриксных белков.

Ключевую роль в наблюдаемых улучшениях сыграло влияние добавок на морфологию и функцию кишечника и матки. Увеличение высоты ворсинок в двенадцатиперстной кишке и повышение экспрессии генов-переносчиков кальция (CALB1, ATP2B1) способствовало более эффективному всасыванию кальция, что подтверждается повышенным уровнем кальция в сыворотке крови. В матке, благодаря улучшению ее морфологии и активации специфических генов (транспортеры Ca2+, HCO3–, Na+, K+), происходила более эффективная доставка ионов к месту формирования скорлупы.

Транскриптомный анализ выявил активацию сигнальных путей MAPK и фокальной адгезии, которые связаны с регуляцией роста, дифференцировки и воспаления. Снижение уровня окислительного стресса и повышение содержания противовоспалительных цитокинов в матке свидетельствуют о том, что комбинация ФЛБ и СТ эффективно смягчает возрастные воспалительные и окислительные процессы в репродуктивном тракте, создавая благоприятные условия для формирования скорлупы.

Не менее важным оказалось влияние добавок на микробиоту матки. Изменение ее состава в сторону увеличения разнообразия и доли полезных бактерий (Bacteroides, Ruminococcus, Rikenellaceae_RC9_gut_group) на фоне снижения условно-патогенных Proteobacteria и Mycoplasma способствовало улучшению микроэкологии органа. Эти бактерии, продуцируя короткоцепочечные жирные кислоты, могут поддерживать целостность эпителиального барьера, влиять на иммунный ответ и способствовать усвоению питательных веществ, что в конечном итоге положительно сказывается на процессе кальцификации.

Таким образом, синергетический эффект комбинации ФЛБ и стевиозида заключается в их способности одновременно воздействовать на несколько ключевых звеньев: улучшать всасывание и транспорт кальция, оптимизировать ультраструктуру скорлупы за счет регуляции экспрессии матриксных белков и ионных каналов, снижать окислительный стресс и воспаление в матке, а также восстанавливать здоровый микробный гомеостаз репродуктивного тракта.

Выводы

1. Добавление в рацион кур-несушек в поздний период яйцекладки комбинации флавоноидов листьев боярышника и стевиозида в дозировке 120 мг/кг каждого компонента (HF120+ST120) является наиболее эффективным для улучшения качества яичной скорлупы.

2. Положительный эффект выражается в повышении прочности и трещиностойкости скорлупы, увеличении ее толщины и оптимизации ультраструктуры, в частности, за счет увеличения эффективного слоя и улучшения структуры сосочкового слоя.

3. Механизм действия включает комплексную регуляцию: улучшение морфологии кишечника и повышение экспрессии генов-переносчиков кальция, оптимизацию структуры и функции матки, снижение окислительного стресса и воспаления, а также восстановление здорового микробного сообщества в матке.

4. Сочетание флавоноидов листьев боярышника и стевиозида демонстрирует синергетический эффект, что делает их перспективной и экономически целесообразной кормовой добавкой для поддержания здоровья яйцевода и продления периода высокого качества яиц у кур-несушек.


Источник: Animal Nutrition